维生素A对动物肺发育影响的研究进展

陈一新，陈欠林，邹莞杰，何余湧*

(1.江西农业大学江西省动物营养重点实验室/营养饲料开发工程研究中心，江西南昌330045；2.宜春市农业科学院)

肺是呼吸系统重要组成部分，是主要的气体交换场所。肺的发育通常被划分为胚胎期、假腺期、小管期、囊泡期、肺泡期5个时期，受多种信号调控。肺发育异常会导致呼吸系统疾病，使用后天手段很难修复。维生素A是脂溶性必须营养素，其活性产物维甲酸(retinoic acid,RA)在肺发育中起重要作用。因此，本文就维生素A及其维甲酸信号通路在哺乳动物肺发育研究进展进行综述，以期为进一步深入研究其在肺发育中的机理及提高动物健康生产提供参考。

1 肺的形成与发育

呼吸系统由前肠腹侧内胚层的一小群细胞发育而来，肺的上皮来自内胚层，间质来源中胚层。前肠腹侧转录因子NKX同源框-1(NK2 homeobox 1,Nkx2-1)的表达可作为呼吸系统发生的标志。Nkx2-1+内胚层细胞向外翻出形成原始气管和两个肺芽。肺芽形成后在中胚层信号的调控下向周围间质延伸，肺芽分支产生了广泛的树枝状气道，这对于产生大的呼吸表面积是至关重要的。这些分支的远端发育形成许多肺泡前体小囊，并与共同发育的血管紧密相连。在肺发育的最后肺泡化阶段隔膜从囊壁生长，将远端的球囊细分为肺泡，从而增加气体交换的表面积，并伴随微血管的成熟[1]。

2 维生素A代谢及维甲酸信号

细胞质内的维生素A（视黄醇）在视黄醇脱氢酶10(retinol dehydrogenase-10,RDH10)作用下产生视黄醛，视黄醛又在视黄醛脱氢酶(RALDH-1,RALDH-2,RALDH-3)作用下产生维甲酸，而肺上皮细胞内过量的维甲酸则通过细胞色素P450 26(cytochromeP450 26,CYP26)酶系来分解，因为CYP酶能将过量的维甲酸迅速降解而使维甲酸不会过量累积[2]，从而使肺上皮细胞内的维甲酸含量保持在正常生理功能范围内。细胞内的维甲酸被细胞维甲酸结合蛋白(cellular retinoic acid binding protein,CRABP)运输到细胞核内与维甲酸受体(retinoic acid receptors,RARs)结合后再与维甲酸X受体(retinoid X receptor,RXR)形成异源二聚体，然后与目的基因的维甲酸反应元件(RA response elements,RAREs)结合，在核受体辅助激活因子 (nuclear receptor co-activator,NCOA)或核受体辅助抑制因子(nuclear receptor co-repressor,NCOR)与RAR作用下激活或抑制转录[3]。

3 维生素A与肺发育

维生素A缺乏会引起呼吸道上皮细胞角质化，使纤毛细胞和杯状细胞脱落，引发下呼吸道感染肺内I型和IV型胶原增加，同时肺泡基底膜厚度增加一倍，内部似乎有I型胶原纤维的异位沉积。维生素A参与肺表面活性物质的合成，如果妊娠期缺乏维生素A，那么胎肺的表面活性物质合成就会降低并导致胎肺畸形[4]。维甲酸能促进胎肺的分支形态发生和结构重构、参与肺的模式形成及气道发育中平滑肌细胞的分化和肺泡化以及平衡肺液的分泌和吸收[5]。在缺乏维甲酸的情况下，由于维甲酸下游分子网络中FGF(fibroblast growth factor)基因、Sonic Hedgehog(SHH)基因、WNT(Wingless/Integrated)基因和HOX(Homeobox)基因的干扰，内胚层就不能正常分化出肺芽原基而阻碍胎肺的正常形成与发育。缺乏维甲酸还会导致囊泡和肺泡中的表面活性物质及弹性蛋白含量下降。

4 维甲酸调节肺发育的机制

4.1 维甲酸对肺发生的影响

RA在肺发生过程中具有多种作用，最初促进侧板中胚层形成，RDH10和RALDH2敲除胚胎后部中胚层表达的心脏神经嵴衍生物表达蛋白1(heart and neural crest derivatives expressed 1,hand1)在前肠异常表达和前肠中胚层表达的间充质转录因子叉头蛋白F1(forkhead box F1,Foxf1)缺失，外源RA可修复这种异常。RA已被证明是Hh上游信号[6]，RA能促进内胚层Hh配体表达，RA缺陷胚胎内胚层Hh配体形成大量降低位于侧板中胚层的下游转录因子GLI家族锌指蛋白1(GLIfamily zinc finger 1,gli1)表达下降。内胚层Hh信号作用于侧板中胚层促进Wnt2/2b和骨形态发生蛋白4(bone morphogenetic protein 4,Bmp4)表达，Wnt2/2b和Bmp4抑制转录因子sox2 (SRY-box transcription factor 2,sox2)在前肠内胚层表达，这对食管和气管的分离是至关重要的。此外，内胚层细胞受RA调节产生Nkx2-1+肺祖细胞，中胚层Wnt和Bmp与肺祖细胞反应启动肺发生[7].RA调节内胚层细胞Nkx2-1表达的机制有待进一步研究。

中胚层FGF10信号是诱导肺芽形成的重要因子，前肠体外培养实验中在RAR拮抗剂(BMS493)作用下因来源于中胚层的FGF10缺失而无法诱导形成肺芽[8],Raldh2-/-动物RA合成受抑制，前肠腹侧肺发生区域标志蛋白Nkx2-1几乎无法产生，同时FGF10信号缺失导致肺发生受阻，这些缺陷能被外源RA修复。外源维甲酸能诱导FGF10产生，Raldh2-/-肺内皮前体细胞在外源性FGF10刺激下发生分化[9]。阻断RA信号，前肠内胚层转化生长因子(transfor-ming growth factor-β,TGF-β)通路被激活[10]内源性Wnt信号拮抗物Dickkopf相关蛋白1(dickkopf WNT signaling pathway inhibitor 1,Dkk1)表达升高，通过产生外源Wnt3a或使用TGF-β抑制剂只能修复一侧肺芽，共同作用下能诱导形成两侧肺芽。而RA处理能通过抑制Dkk1促进WNT表达，并同时抑制TGF-β信号，最终促进FGF10表达，产生肺芽[11]。

HOXA1在肺发育早期表达，RARE存在于HOXA1启动子，HOXA1受RA直接调控[12]，HOXA1和配对盒基因1/2 (Pbx homeobox protein,Pbx)对Raldh2表达和维甲酸活性起作用，Pbx1/2 null胚胎因器官发育缺陷死亡[13]，与RA缺陷表型类似。HOXA1缺陷导致的表型异常可被亚致畸量的外源RA部分修复[14]。Antonio Vitobello等通过免疫共沉淀鉴定了一个特异的Raldh2增强子[15]，该增强子含有一个HOX-PBX二段元件，与HoxA1-Pbx1/2-Meis2复合物结合，并需要在内源性Raldh2启动子的背景下维持正常表达水平。Guangsong Su等使用CRISPR/Cas9敲除胚胎干细胞HOXA1的一个增强子抑制了RA诱导的HOXA1表达[16]，CRABP1和控制内胚层发育基因表达降低。HOXA1突变猪胚胎转录组数据表明，HOXA1突变导致CRABP1表达下调和CYP26A1表达上升[17]，另外，HOXA1突变导致早期胚胎内胚层分化相关基因表达异常，使得内胚层分化出现异常，初生动物呼吸急促并在围产期死亡[18～19]。HOXA1是维甲酸的目标基因,Bony De Kumar等对胚胎干细胞使用全基因组分析发现SOX2是HOXA1的直接作用基因[20]，SOX2在肺上皮细胞表达,对食管气管分离起重要作用,维甲酸是否通过影响HOXA1调节SOX2表达有待进一步研究。

4.2 维甲酸对肺气道生长的影响

肺芽形成后，通过域分支，平面分叉和正交分叉三种分支模式向周围生长[21]，肺芽远端中胚层产生的FGF10信号是诱导肺分支的重要因子,侧芽出现后远端气道间质RALDH-2表达降低，维甲酸信号拮抗物COUPTF-II表达升高,RA水平降低,RAR活性受抑制以允许肺分支相关基因表达,如Fgf10和Bmp4[22]。使用RAR拮抗物降低了肺分支抑制基因TGF-β3、叉头框架蛋白A2(forkhead box A2,Foxa2)在气道近端表达[23]。鸡肺体外培养实验补充RA后，SOX2的表达水平几乎保持不变，气道远端SOX9的表达水平以一种剂量依赖的方式下降，FGF10和FGFR2轻度下降，导致远端上皮多功能祖细胞的减少，并诱导近端分化[24]。

气道发育伴随着来源于间充质的平滑肌发育，域分支中平滑肌较固定地在分支底部分化，平滑肌减少会导致异常分支，平滑肌增加会抑制分支起始和延伸[25]。内源性RA能抑制气道分支远端平滑肌分化，RA缺乏状态下发育中的肺气道平滑肌分化相关基因平滑肌肌动蛋白α2(actin alpha2,smooth muscle,Acta2)和肌球蛋白重链11 (myosin heavy chain 11,Myh11)等表达增加,气道平滑肌过度分化并在气道最远端芽的茎部区域表达，这种异常改变在出生后持续存在[26]。气道平滑肌中RA信号的中断导致TGF-β配体产生增加，继而TGF-β通路过度激活，阻断TGF-β通路可以阻止RA缺乏引起的平滑肌表型改变[27]。

RA处理培养的E17大鼠肺组织块后，Hox A5、B5和B6mRNA水平显著增加，且呈剂量和时间依赖性,RA还能通过上调肺HOXB5蛋白表达影响肺分支[28～29]。

4.3 维甲酸对肺泡发育的影响

在整个小管期和囊泡期，末端管转变成由初级隔膜分隔的小球囊。在肺泡发生过程中，囊被次生脊分割。肌成纤维细胞前体细胞、内皮细胞、成纤维细胞和脂成纤维细胞覆盖次级隔膜，基质蛋白(如弹性蛋白)沉积在顶端[30]。随着肺泡的成熟，周围的毛细血管重塑，内皮细胞位于肺泡Ⅰ型上皮细胞细胞的附近，提高气体交换效率。这个过程被称为微血管成熟，与肺泡化同时发生。

维甲酸可增加初生动物肺泡数目[31]，促进肺泡Ⅱ型细胞活力抑制其凋亡并向肺泡Ⅰ型上皮细胞转换[32]，促进肺成纤维细胞弹性蛋白表达沉积[33]，这对肺泡成熟是重要的。RAR-α缺失不会改变早期肺泡数目和表面积，但会降低发育后期肺泡数目和表面积，表明RAR-α对肺泡间隔不是至关重要的，但可能在肺泡发育的后期起作用[34]。RAR-γ缺失导致弹性组织和肺泡数减少,RXR等位基因的额外缺失导致肺泡表面积减少，表明RAR/RXR异源二聚体参与肺泡形态发生[35]。RAR-β基因敲除导致肺泡间隔更早形成，肺泡形成更快[36]。新生动物内皮细胞RA合成减少抑制肺成纤维细胞FGF-18和弹性蛋白的表达，损害肺泡化。维甲酸和维生素A可部分逆转血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)抑制所导致的肺泡发育受损[37]。Cyp26b1-/-动物肺组织表现为气道上皮细胞分化异常，肺泡Ⅰ型上皮细胞减少，肺泡充盈失败初生动物死亡[38]。全反式维甲酸可以提高胎肺表面活性蛋白B的mRNA和蛋白表达[39]，可能通过促进血小板衍生生长因子 (platelet derived growth factor,B polypeptide,PDGF)表达促进成纤维细胞增殖[40]，进而肺泡细胞间隙连接蛋白43(Connexin 43,Cx43)促进肺泡化[41]。维生素A缺乏会导致肺组织基底膜增厚，并含有散状I型胶原纤维，TGF-β1表达上升，饲喂全反式维甲酸可以降低TGF-β1表达和基底膜厚度[42]。维生素A缺乏会导致Ⅳ型胶原、层粘蛋白沉积和肺对蛋白的水解能力的改变，维甲酸可修复这种缺陷[43]。维甲酸能促进体外培养肺血管内皮细胞生成血管[44]。妊娠早期短暂抑制维甲酸信号,血管生成减少,Ⅳ型胶原沉积减少,周细胞与内皮细胞基底膜完整性受损,平滑肌肌动蛋白高表达升高。肺发育不全为先天性膈疝(diaphragmatic hernia,CDH)表现之一，维甲酸能抑制CDH肺细胞异常分化，并对肺血管形成有一定的促进作用[45]，可能是通过促进VEGF，VEGFR1及VEGFR2表达调节[46]。RA可能通过ERK/Jak-STAT通路促进肺气肿动物肺泡上皮细胞再生[47]。使用RXRs激动剂可以降低肺气肿动物气道炎症和改善基质技术金属蛋白酶和抗蛋白酶平衡[48]。

5 小结

目前相关文献已经证明维生素A在哺乳动物肺发生发育过程起重要作用，通过阻断或激活维甲酸信号通路已经证明了部分维甲酸参与肺发育的机制，随着单细胞转录组测序等技术的应用，发育肺内胚层与中胚层之间信号相互作用与受维甲酸调控下游信号分子机制还有待进一步研究。