癌因性疲劳动物模型的研究进展

金铭，谢露露，毛妮，沈旭波，魏建子，沈雪勇，毛慧娟

0 引言

癌因性疲劳（cancer-related fatigue,CRF）作为较为常见的癌症治疗相关症状之一[1]，是指由于癌症及其相关治疗导致患者长期痛苦和紧张而产生的一系列主观感觉，常表现为持续的疲惫感，与近期活动不成比例并且干扰了患者的正常功能[2]。据统计25%～99%的患者在治疗期间经历了CRF[3]，严重影响了患者的正常生活。尽管近些年来出现越来越多的新型癌症治疗方法，但化疗仍是运用广泛的治疗手段，它会导致CRF的形成并/或加重其程度。目前关于CRF发病机制的假说主要包括细胞因子失调、下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴调节失常、神经递质传导异常、三磷酸腺苷和肌肉代谢改变、贫血以及社会心理因素等[4]，但关于CRF的有效治疗方法仍未有定论。因此建立CRF的相关临床前模型以探究其机制，并区分不同干预效果的差异进而发现特定的治疗靶点显得尤为重要。本研究通过查阅国内外CRF动物模型相关文献并进行归纳总结，以期为今后CRF造模方案提供依据。

1 动物选择

啮齿类动物是临床较常选择的化疗动物模型，其具有体型小、繁殖迅速、操作简单及品系种类多等优势。目前文献报道中常使用的小鼠品系多为6～10周的C57BL/6小鼠[5-7]、BALB/c小鼠[8-10]和ICR（CD-1）小鼠[11]。大鼠品系则多为8～12周的Sprague-Dawley（SD）大鼠[12-14]、仅少部分实验选择Wistar大鼠[15]。小鼠经17世纪人工培育至今，拥有数目众多的近交系、突变系及封闭群，荷瘤或化疗后产生的生理病理现象与人类存在一定的相似性[8,16]，但由于小鼠体型较小，化疗药物剂量难以控制易致其死亡，故部分实验者采取大鼠作为造模对象。大鼠较小鼠性格更温和，实验操作相对简便，且对化疗药物敏感[17]，易产生相关不良反应。

2 造模方式

2.1 化学疗法诱发的CRF模型

临床最常用作化疗造模的药物包括抗生素类（阿霉素）、抗代谢类（5-氟尿嘧啶）、生物碱类（紫杉醇）、烷化剂类（环磷酰胺）、细胞毒类（奥沙利铂、顺铂）或其中某几种的联合用药方案（CAF方案：环磷酰胺，阿霉素，5-氟尿嘧啶；铂-紫杉烷联合化疗方案等），这一部分实验使用没有肿瘤的动物模型，以避免混淆肿瘤和药物的抗肿瘤作用之间存在的相关影响。因此，该模型可以模拟临床癌症患者手术切除原发性肿瘤后仍继续接受化疗预防肿瘤转移的情况。

2.1.1 抗生素类 Hayward等[12]分别在第1、第3和第5天对成年雄性SD大鼠进行单次腹腔注射15 mg/kg的阿霉素（Doxorubicin,DOX），Quinn[13]和Bredahl等[14]也选择了相似的造模对象及方法，Park等[18]虽然同样选择SD大鼠（8周，200 g）为实验对象，但其造模方案为每周一次腹腔注射DOX（2 mg/kg），持续4周。de Lima等[15]则将Wistar大鼠作为研究对象，腹腔注射DOX（15 mg/kg）后发现模型组符合临床恶病质的表现，如体重减轻、厌食症及全身代谢紊乱等。Zombeck等[11]选取雌性7周ICR（CD-1）小鼠，在适应性喂养后的第1～3天和第10～12天腹腔注射DOX（2.5 mg/kg），模型组中DOX累积剂量为15 mg/kg。de Lima等[5]对8～10周的雄性C57BL/6小鼠进行每周2次，持续6周的DOX（2.5 mg/kg）注射进行造模。

2.1.2 抗代谢类 Dougherty等[6]选取7～8周的C57BL/6N小鼠造模，在第7天以80 mg/kg的5-氟尿嘧啶（5-Fu）进行腹腔注射，第14天改以60 mg/kg的5-Fu再次进行注射。齐晓晔等[19]先将6 mg/10 ml的5-Fu溶液溶于磷酸盐缓冲液（phosphate belanced solution,PBS）中；在第1～5天通过连续向腹腔内注射剂量为60 mg/kg的5-Fu进行造模。Sougiannis等[7]选取10周的雄性C57BL/6小鼠，将5-Fu分3周期给药：周期1向小鼠腹腔内注射40 mg/kg的5-Fu，周期2、3则将5-Fu的浓度改为20 mg/kg。每周期包括5天的注射周期及9天的间隔时间，总造模周期为42天。

2.1.3 生物碱类 Loman等[8]选取7～8周的雌性BALB/c小鼠进行造模，每次向腹腔注射100 μl的浓度为30 mg/kg的紫杉醇（Paclitaxel,PTX），隔天注射，持续12天。Ray等[9]对麻醉后小鼠进行内眦静脉注射PTX（10 mg/kg），每天1次，连续5天。Chaillou等[20]通过向8～11周的雌性FVB/N小鼠尾静脉注射多西他赛（20 mg/kg）进行造模。

2.1.4 细胞毒类 Sorensen等[10]选取6周的雄性BALB/c小鼠作为造模对象，在适应性喂养后的第1、3、5、8、10和12天向小鼠腹腔内注射奥沙利铂（3 mg/kg）。Sakai等[21]选取8～9周，体重为23～27 g的雄性C57/6J小鼠，向小鼠腹腔内连续4天注射顺铂（3 mg/kg）。

2.1.5 烷化剂类 Crouch等[22]选取16周的雌性C57BL/6J小鼠，通过尾静脉内注射单次剂量300 mg/kg的环磷酰胺（Cyclophosphamide,CTX）进行造模。

2.1.6 联合化疗方案 Barreto等[23]选取CD2F1雄性小鼠造模，先向小鼠腹腔注射伊立替康，2 h后再注射5-Fu（每周2次，持续5周）。Wong等[24]将CTX（167 mg/kg）联合DOX（4 mg/kg）（CA方案）作为化疗方案，给雌性C57BL/ 6小鼠（10～12周，18～21 g）通过腹腔注射进行造模。Weymann等[25]选取8～12周的雌性C57BL/6J小鼠及250～350 g的雄性SD大鼠，选取CTX、DOX和5-Fu（CAF方案）作为化疗方案，分别以167 mg/kg、4 mg/kg和167 mg/kg的浓度给予小鼠和75 mg/kg、4 mg/kg和75 mg/kg的浓度给予大鼠，给药周期均为3周内间隔给药4次，以诱导CRF模型。

2.2 肿瘤诱发的CRF模型

近一半的患者在确诊时就已经感觉疲劳，这或许是肿瘤生长需要与身体其他组织的代谢竞争所导致的[26]。肿瘤的增长会导致全身性炎性反应的发生，炎性细胞因子激活NF-κB，导致荷瘤小鼠肌肉功能减退及力量的损失[27]，产生疲劳样行为。目前实验中较常采用的是小鼠C26结肠腺癌细胞，人MCF-7乳腺癌细胞及小鼠Lewis肺癌细胞来诱导癌症恶病质模型，其中C26结肠腺癌细胞小鼠模型是目前使用最广泛的恶病质模型[28]，这可能与临床肿瘤发病率、存活率及造模成功率存在一定联系。

Norden等[29]选取10周的雌性BALB/c小鼠，向其肩胛骨皮下注射结肠26腺癌（C26）细胞（细胞密度：2.5×106个/毫升，0.2毫升/只）以模拟结肠癌癌性疲劳。Grossberg等[30]选取5种肿瘤模型探究CRF模型，分别是人乳头瘤病毒（HPV）相关头颈部肿瘤模型（mEER，细胞密度：1×107个/毫升，0.1毫升/只）；Lewis肺癌模型（LLC，细胞密度：5×106个/毫升，0.1毫升/只）；卵巢癌ID8模型（细胞密度：1×107个/毫升，0.1毫升/只）和IG10模型（细胞密度：1×107个/毫升，0.1毫升/只）；HPV阴性头颈癌模型（shPTPBL/hRas；细胞密度：1×107个/毫升，0.1毫升/只），将mEER、shPTPBL和LLC细胞重悬于无菌PBS中，将ID8和IG10细胞重悬于Hank's平衡盐溶液（Hank's Balanced Salt Solution,HBSS）中，选取10～13周的雄性C57BL/6J小鼠分别进行注射造模。Vichaya等[31]选取mEER和LLC细胞进行荷瘤小鼠的造模。

2.3 肿瘤加化疗共同诱发的CRF模型

部分癌症患者因为癌症部位、分型或分期而无法直接进行手术切除肿瘤，所以围手术期化疗是大多数患局部晚期癌症患者的首选治疗方法，以达到最佳治疗效果提高患者存活率。除了肿瘤的生长会导致机体炎性反应的发生[27]，部分化疗药物也会因其药理作用而诱发炎性反应，导致疲劳的发生。

Gilliam等[32]将乳腺癌细胞（E0771）接种到卵巢被摘除的雌性C57BL/6N小鼠（12周）皮下第4对乳腺的右垫上（细胞密度：5×106个/毫升，0.1毫升/只）以模拟更年期乳腺癌患者。待肿瘤长至100～150 mm3，再对其进行单次皮下注射DOX（20 mg/kg）进行造模。Park等[33]选取18～20g的5周龄雌性BALB/c小鼠作为实验对象，肿瘤细胞选取HT-29人结肠直肠癌细胞（KCLB 30038），在热灭活牛血清的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中于37°C下培养，隔天更换培养皿。将在DMEM中培养的HT-29（细胞密度：2.5×107个/毫升，0.2毫升/只）皮下注射到小鼠的右腹，所有接种的小鼠在14天内形成肿瘤，当肿瘤大小达到100～150 mm3时开始造模，在28天内通过向小鼠腹腔内注射3次5-Fu（30 mg/kg）以造成疲劳。Ouyang等[34]发现荷瘤及荷瘤加化疗均可成功诱导CRF模型，实验对象为16～20 g的5～6周雄性BALB/c小鼠，在RPMI 1640和基质胶中培养的A549细胞（细胞密度：2.5×107个/毫升，0.2毫升/只）将会从皮下注射到小鼠的右腹造成肿瘤模型，肿瘤在7天内形成，当肿瘤大小达到80～100 mm3时开始进行化疗，向小鼠腹腔内注射剂量为10 mg/kg的顺铂（每2天1次，持续3周），实验结束后发现肿瘤和顺铂均可以引起疲劳，还观察到与肿瘤本身引起的疲劳相比，顺铂诱发的疲劳发生得更早、更严重。

3 造模成功的评估方法

动物的疲劳表现为自愿活动减少，故目前实验中将重点放在观察造模后动物的自愿活动量的改变上，主要评估方法包括：轮式跑步实验（自愿跑轮实验）、跑步机实验、握力试验、暗箱实验、肌肉功能及线粒体含量的测定等。其中轮式跑步实验常作为疲劳评估的主要终点指标，但由于动物种类繁多，缺乏统一客观的评估方法，故评估时多将几种方法联合作为结局指标。

3.1 轮式跑步实验

轮式跑步实验自1898年由Stewart提出，至今仍是目前动物模型中应用最广泛的衡量癌症相关疲劳程度的实验之一[35]。自愿跑轮可以反映啮齿动物的昼夜节律活动并且可以观察到运动量的变化及进食量，能在一定程度上反映出动物的生理病理状态。为防止动物不适应跑轮，研究者们一般会在实验前对动物进行至少一周的训练[30]，大部分实验造模后发现，模型组自愿跑轮活动减少[11,24-25]，且跑轮时间、平均速度、最快速度及体重均明显低于对照组[24]，但也有部分实验在造模结束后显示模型组与对照组的自愿活动没有明显差异[36]，这可能与动物的种类及品系不同有关。

3.2 跑步机实验

跑步机实验指的是在跑步机的后部放置一个带电的金属格，如果动物停下来，网格上会有电流通过，促使它们必须不断的跑步，通常将疲劳定义为动物在电击网格的顶部连续停留五秒钟，同时面对反复的刺激仍不愿继续奔跑。这种测试方法能体现化疗诱发的疲劳样行为[6]，并且可能更加适用于不同品系的啮齿类动物，其适用范围更广。不过在一些实验中发现大鼠在跑步机训练后，肌肉功能被改善的同时，也产生了一定的肌肉损伤[37]，因此跑步机的实践应用仍需要进行更多实验来加以说明。

3.3 肌肉功能及线粒体含量的测定

癌症本身及化疗药物都会引起肌肉萎缩及疲劳，导致氧化磷酸化速率的降低而造成线粒体代谢异常，骨骼肌功能减弱[27]。实验取材后通过评估动物离体骨骼肌发现，模型组的比目鱼肌及趾长伸肌的功能减弱及质量减轻，此现象符合CRF动物的病理表现[10,12-14,21]。个别实验造模结束后发现，模型组的比目鱼肌和趾长伸肌的功能及重量未见明显减轻[20]，可能是药物剂量未达到造成疲劳的程度。

4 结语

CRF动物模型的建立对探究CRF的发病机制和治疗方法具有重要意义。了解各种模型的实验动物选取标准、关键操作方法、主要评估方法是造模成功的关键。大部分实验在正式实验开始前会进行一周的适应性喂养，常用的药物注射方式有腹腔注射、尾静脉注射，少数选择内眦静脉注射。虽然实验中研究对象多为雄性大鼠或小鼠，但有实验发现与雄性鼠相比，荷瘤雌性鼠的炎性反应及体重减轻相对较小[38]，并且雄性比雌性更容易发生撕咬，引起局部炎性反应，易对实验结果造成不利影响，这对后期实验选择模型对象提供了参考。荷瘤模型常用于观察单由肿瘤引起的疲劳样行为，化疗诱发模型多用于观察化疗药物带来的不良反应而引起的疲劳，荷瘤加化疗的模型则是模拟临床晚期局部肿瘤治疗情况。

目前建立规范化CRF动物模型存在的限制条件在于临床多种癌症均可出现CRF，无法进行统一，肿瘤细胞的品系不同、化疗药物的种类及剂量之间的差异均可对模型表现产生影响。另外啮齿类动物不同品系之间也存在差异。

CRF模型建立成功的另一个关键点在于人类和啮齿类动物的药物剂量转换。啮齿动物和人类之间的药物药代动力学和药效学差异显著，这种情况带来的潜在问题是，与人体体内使用的剂量相比，大小鼠体内药物换算的剂量将会诱导其衰老进而使实验结果产生偏差。此外，除了关注单次注射药物的浓度，累积的药物毒性也不容忽视。

单一的化疗诱导模型或荷瘤模型难以复制临床癌症的复杂性，期待通过继续探索CRF可能的发生机制和找寻合适方法建立更好的CRF动物模型，为临床指导CRF的治疗研究提供理论依据。