PI3K/AKT通路与骨质疏松症的关系及中医药干预的研究进展

林德民 谢兴文 李宁 徐世红 李鼎鹏 柳博 姜朝阳 赵建伟

1.甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730000

2.西北民族大学附属医院，甘肃 兰州 730000

3.甘肃省第二人民医院，甘肃 兰州 7300004

4.甘肃中医药大学附属医院，甘肃 兰州 730000

5.甘肃省中医院，甘肃 兰州 730000

骨质疏松症(osteoporosis，OP)，是临床常见的一种骨代谢疾病，其发病机制与破骨细胞(osteoclast，OC)及成骨细胞(osteoblast，OB)共同影响并介导的“骨平衡”失衡关系密切。大量研究表明，PI3K/AKT通路能调控相关细胞，引起“骨平衡”偏移。中医药治疗OP由来已久，在治疗不同类型OP中都有明确效果。部分研究提出，中医药干预能明显影响PI3K/ AKT通路相关蛋白表达，这也许是中医干预治疗OP的重要机制之一。

1 PI3K/AKT信号通路

1.1 PI3K/AKT信号通路的组成

磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide3-kinase，PI3K)，是一种位于胞质的脂质激酶，由调节亚单位P85(一个相对分子质量为 85 ×103)和催化亚单位P110(相对分子质量为110 ×103)的异源二聚体所构成，共有Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型三种类型。PI3K兼具丝氨酸/苏氨酸(Ser/Thr)和磷酯酰肌醇激酶双重活性，并在细胞膜大范围的信号转导、膜转运和代谢过程中起着关键调节作用[1-2]。当前研究发现，PI3K所合成的活化后产物磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸(PIP3)在接受特定的刺激并作为“第二信使”调控细胞生命活动中具有关键作用[3]。

丝氨酸/苏氨酸激酶(serine/threonine kinase，AKT)，即AKT蛋白，亦名蛋白激酶(protein kinase，PKB)，是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(有480个氨基酸残基)。结构分析可以发现，AKT结构上分为PH结构域、催化域及调节域共3部分；其中，PH结构域与蛋白激酶A、蛋白激酶C相似并高度保守[1]。当AKT蛋白未活化，PH结构域遮盖活性区域；活化时，该结构域与PIP3结合，影响下游信号分子，参与并调控细胞的相关生命活动[4-5]。

1.2 PI3K/AKT通路激活

1.2.1激活过程：位于胞膜附近的PI3K可被膜上受体酪氨酸激酶(RTKs)、脾酪氨酸激酶(SYK)、d大鼠肉瘤蛋白(RAS)、G蛋白耦连受体(GPCRs)、JAK激酶(Janus kinase)等激活[6]。上游信号分子刺激后，处于胞质区位置自身磷酸化的酪氨酸残基与P110结合，PI3K被募集至质膜，P85进入质膜内表面，磷脂酰肌醇4,5-双磷酸(PIP2)磷酸化后与P110结合，大量磷酸酰肌醇-3-磷酸(PI3P)及磷酸酰肌醇-3,4,5-三磷酸(PI-3,4,5- P3)，磷酸酰肌醇-3,4-二磷酸(PI-3,4- P2)形成。下游信号分子AKT/ PKB结合后将从胞浆转移到质膜上，其构象则会发生变化，即PH结构域对其催化活性部位的抑制解除，从而激活AKT/ PKB的激酶活性[7-8]。

1.2.2PI3K/AKT通路对成骨细胞的影响：OB起源自间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)，在参与调节骨形成过程中起重要作用。大量文献研究指出，雄激素、锌、N-钙黏着蛋白骨形态发生蛋白2、4、7、9及其亚家族成员等，都能够通过PI3K/ AKT通路促进OB增殖、分化。Huang等[9]研究指出，PI3K/ AKT在加快OB增殖同时，也可以通过Wnt/β-catenin、生长激素/胰岛素样生长因子1等多种途径，促进OB增殖分化。有研究[10]发现，激活的PI3K能够调节p53、cyclin D1及caspase-3/9蛋白的水平，降低PSMC6诱导的OB凋亡，促进细胞增殖。Pan等[11]实验数据揭示，PI3K/ AKT通路参与糖皮质激素(glucocorticoids，GCs)诱导OB成骨抑制的过程并在其中起到一定作用。同时，PI3K/Akt/mTOR通路在原硅酸介导的体外成骨过程中也起着积极的调节作用[12]。另有国内学者[13]发现，脉冲电磁场(pulse electromagnetic fields，PEMF)可通过OB表面初级纤毛激活PI3K /AKT通路，促进骨形成活性。

1.2.3PI3K/AKT通路对破骨细胞的影响：OC起源自骨髓造血干细胞，直接参与骨吸收过程。大量研究表明，PI3K/AKT通路与OC间存有重要联系。PI3K/ AKT通路可通过影响巨噬细胞集落刺激因子受体(M-CSF)及核因子-κB受体活化因子配体(RANKL)，在OC存活、分化以及“骨平衡”中产生影响[14]。当PI3K/AKT通路被抑制时OC的形成减少。动物实验证明，PI3K抑制剂LY294002能明显抑制磷酸三钙(tricalcium phosphate，TCP)磨损颗粒介导的小鼠颅骨溶解和OC形成，BMD值增加[15]。miR-363-3p[16]、肿瘤坏死因子α及炎症因子等信号能够通过PI3K/AKT途径，直接或间接促进OC生成，影响OP的发病。

2 中医药干预PI3K/AKT通路

2.1 中药单体

大量研究文献指出，中药在OP治疗中有着确切的疗效，目前，中药单体的相关研究也引起越来越多国内外专家的重视，相关研究也证实中药在OP治疗中具有不可替代的作用。

动物实验发现，PI3K/ AKT通路介导下，不同浓度丹参素和白藜芦醇均可以升高骨密度值，降低OP大鼠相关细胞凋亡率，抑制如 cyto- C、Bax、AIF等相关蛋白的表达[17]。在对丹参单体进一步实验发现，其有效成分中丹酚酸B，能明显上调PI3K及p-AKT表达，激活PI3K/AKT通路进而刺激MC3 T3-E1细胞骨形成[18]。也有研究指出，丹酚酸A也能降低TNF-α、IL-6水平，使AKT磷酸化水平上调，降低Bax蛋白的表达[19]。同时，中药丹参有效成分中的紫草酸镁B(MLB)可以通过诱导AKT磷酸化，显著提高内皮型一氧化氮合酶(eNOS)磷酸化水平从而恢复微循环障碍，恢复受损大鼠后肢血流[20]。

中药黄芪的研究中发现，其提取物毛蕊异黄酮(Calycosin)在成骨作用部分涉及 IGF1 R/ PI3K/ AKT通路，在10-8～10-6mol/L范围内对细胞增殖、碱性磷酸酶活性和茜素红S染色均有剂量依赖性的增强作用，而在10-5mol/L范围内有抑制作用；在最佳浓度时，可以增加成骨基因的mRNA水平和IGF1R和AKT的磷酸化；此外，GSK或LY治疗后可部分逆转毛蕊异黄酮对ROBs的影响，表现为毛蕊异黄酮诱导的ALP活性降低、钙化结节和成骨基因表达减少[21]。

淫羊藿的主要活性成分之一淫羊藿苷(Icariin)能够对GCs诱导的SaoS-2细胞和小鼠OP变化有保护作用；实验中发现，DEC1(一种结构独特的螺旋环螺旋蛋白)的过度表达和敲除分别反向调节Wnt/β- catenin和 PI3K/ AKT信号通路中的关键分子β- catenin和 PIK3 CA的表达，Wnt/β- catenin信号抑制物 DKK1和 PI3K/ AKT信号抑制物 LY294002抑制了淫羊藿苷对 DEC1的诱导作用，研究指出，DEC1在 PI3K/AKT/GSK3β/β- catenin综合信号通路支持淫羊藿苷抗GCs型OP的作用[22]。

有实验研究发现，从川续断根分离的一种由半乳糖和甘露糖组成，分子量为2.61×104Da的均一多糖(DAP)，能够通过上调VEGF和骨保护素(osteoprotegerin，OPG)，下调RANK和RANKL蛋白和mRNA的表达，激活PI3K/Akt/eNOS通路以达到预防和治疗绝经后OP[23]。

实验发现，马齿苋能有效抑制PI3K、Akt、雷帕霉素哺乳动物靶点(mTOR)、NF-κB的磷酸化及NF-κBα(IκBα)表达，并通过PI3K/Akt/mTOR和Nrf2/HO-1/NF-κB途径达到抗炎和抗氧化作用[24]。同时，马齿苋中分离得到(E)-5-羟基-7-甲氧基-3-(2′-羟基苄基)-4-色曼酮分析发现，(E)-5-羟基-7-甲氧基-3-(2′-羟基苄基) -4-色曼酮可以激活并促进3T3-L1脂肪细胞的PI3K/Akt及AMPK途径刺激葡萄糖转运蛋白GLUT4向质膜转运，提高葡萄糖摄取，预防脂多糖诱导的骨量丢失[25]。

人参及其组方在OP治疗由来已久，研究发现，人参酚酸提取物(PG2)能影响PI3K/Akt/eNOS通路的磷酸化，增加细胞活力，抑制棕榈酸酯诱导的细胞内脂质积聚及内皮素1(ET-1)过度表达，从而发挥保护内皮功能的作用[26]。

另有研究指出，灯盏花素、银杏内酯B、北五味子乙素等均能在PI3K/AKT通路介导下，影响相关细胞凋亡。

2.2 中药复方

中医药治疗OP由来已久，尽管中药成方针对不同患者组方选药并不完全相同，但就总体效果而言，中医药治疗OP有着显著的效果。

实验证明，中药成方补肾活血方含药血清能够在PI3K/AKT通路介导下影响OB增殖，同时激活p38 MAPK和 PI3K/AKT通路介导OB分化，研究认为，p38 MAPK及 PI3K/ AKT是补肾活血方在OP治疗中的主要作用机制[27]。有学者在对经典方剂鹿角胶丸研究中指出，鹿角胶丸有效成分可以通过 PI3K/AKT通路，增加 OC凋亡，并在此过程中促进Bcl-2的表达，抑制Bax的表达，抑制Caspase 3的裂解[28]。动物研究发现，四物汤能够直接或间接影响GPER通路，调节在GPER相关下游信号分子PI3K、p- AKT表达，促进OB增殖[29]。对成方恒古骨伤愈合剂的研究中也有发现，其有效成分可通过调控PI3K/ AKT通路促进OB增殖治疗绝经后OP[30]。其他中药成方如当归补血汤、和血生络方及益气化瘀汤等，均能够通过PI3K /AKT通路介导，影响相关细胞增殖和凋亡。

2.3 针灸

针灸作为传承已久的中医治疗手段之一，近年来越来越多地被应用于OP治疗及辅助治疗之中。大量动物研究证实，针刺对OP模型小鼠存有一定疗效。在对相关机制探究中，PI3K/AKT被证明是针刺治疗OP的一个重要途径。

动物实验表明，对卵巢早衰大鼠针刺后，大鼠体内PI3K/ AKT/ mTOR通路mRNA及蛋白表达量升高，血清雌二醇(estradiol，E2)分泌恢复至正常，卵巢功能基本恢复，在治疗效果上，与雌激素治疗效果相当[31]。这也为绝经后OP患者的治疗研究提供了新的方向。在MCAO模型小鼠针刺研究中，免疫组化及Western blotting显示：针刺“曲池”“足三里”穴位后，PI3K、AKT磷酸化水平均有所提升，同时，Bax表达抑制明显[32]。还有研究指出，深刺“环跳”穴可以影响PI3K/AKT通路，抑制大鼠坐骨神经损伤后的神经细胞凋亡，促进神经损伤修复[33]。动物研究指出，电针刺激大鼠内、外膝眼可激活PI3K/AKT，影响 Bcl-2、Bax等相关蛋白表达，并减少相关炎症因子IL-1β、TNF-α生成，抑制相关细胞的凋亡[34]。也有国内学者[35]研究指出，电针刺激可 PI3K/AKT介导骨髓内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)，促进相关区域血管再生。

穴位埋线治疗作为近些年发展起来，针灸治疗的一个延伸。相关研究发现，穴位埋线能够直接或间接影响PI3K/AKT通路，上调相关蛋白，如GLUT4蛋白表达，调整相关激素水平。

3 小结及展望

PI3K/AKT通路是OP发病机制中一种重要细胞信息传导途径，该通路能够通过对OB、OC及 VEGF、NO及缺氧诱导因子等多种与血管再生方面的相关因子等信号加以调控，在OP的治疗中发挥重要作用。但有部分研究提出，该通路激酶3β的水平下对可调控因子发挥双向调节作用，由于目前缺乏对激酶3β定量分析和研究来确定准确的界限的相关研究，单纯通过PI3K/AKT通路治疗OP仍存在着较大限制。

动物实验及其他实验发现，中药单体及中药成方的有效成分，针刺等中医药治疗手段均能够通过直接或间接激活 PI3K/AKT通路，调控下游相关信号分子，影响OB、OC等相关细胞分化及增殖。但由于中药中有效成分较多，分离作用成分及确定中药成方中发挥作用的主要有效成分仍是亟待解决的主要问题。

目前研究证实，多种中医治疗手段如针灸、方剂等在治疗OP中均有着确切、显著的效果，而PI3K/AKT是这些干预手段中主要作用机制之一，这也为OP治疗相关机制研究提供了思路。以PI3K/AKT通路这一支点，更多OP治疗手段将会被发掘，PI3K/AKT通路也能够为更多新药研发提供更多思路及重要靶点。更多的中医药治疗方法的作用机制的发现，也会更加的有利于中医的推广和普及。