牛黄及其代用品掺杂伪品的鉴别

杜 娟

牛黄源于牛科动物牛的胆管或胆囊中的结石，是一种病理产物[1]。天然牛黄稀少而价格较高，针对这一现状，我国科研工作者研制出牛黄代用品：人工牛黄、体内培植牛黄、体外培育牛黄等，并已收录于2015年版《中华人民共和国药典》[1]。牛黄代用品价格相对低廉，可以更大程度上满足日渐增高的市场需求。但牛黄药材市场中时常发生牛黄代用品掺伪问题，此种情况严重降低牛黄的质量，直接影响临床用药的安全性与有效性[2]。(牛黄Bovis Calculus、牛Bos taurus domesticus Gemlin)

1 牛黄及代用品种类

1.1 天然牛黄现代医学研究认为天然牛黄是因为肝胆疾患引起的。其主要成分有胆色素类、胆汁酸(包括游离型和结合型胆汁酸)、脂肪酸、胆固醇、氨基酸、卵磷脂等。天然牛黄在我国按照产地不同可分为东牛黄、西黄、苏牛黄、京牛黄，其中京牛黄和苏牛黄多为胆红素-胆固醇结石，东牛黄多为胆红素结石。

1.2 人工牛黄依照天然牛黄的主要成分表，将胆红素、牛磺酸、猪去氧胆酸、牛胆粉、胆固醇、磷酸三钙、硫酸镁等与淀粉混合，制成人工牛黄。

1.3 体内培植牛黄20世纪70年代我国成功研制出体内培植牛黄。经外科手术的方式，将致黄因子(特定异物)植入活牛胆中，并注射一种菌液，能促进牛黄的产生。主要由胆红素钙、胆汁酸类、蛋白质、氨基酸以及微量元素等组成。因与天然牛黄的形成环境大体相同，有研究指出二者含有成分、理化性质和药理作用等无明显差异。但由于遭受医学伦理质疑，且周期长、成本高，未能在市场上广泛流通，也未被《中华人民共和国药典》收录。

1.4 体外培育牛黄20世纪70年代我国因生物工程技术快速发展，成功研制出体外培育牛黄，模拟体内天然牛黄形成的原理和环境，通过物理生化方法使牛胆汁生成牛胆红素钙结石[3]。其化学成分、理化性质及药理作用与天然牛黄大体相似。

2 牛黄及其代用品的鉴别

2.1 性状鉴别天然牛黄的物理性状特点是表面鲜棕黄色、质地松脆、蛋黄完整、断面纹路细腻清晰。人工培植牛黄是通过外科手术的方法在活体牛的胆囊内留置致黄因子，进而生成牛黄。人工培植牛黄质地松而轻，呈土黄色，为疏松的粉末，味苦微甜，入口后无清凉感，气略腥而微清香。天然牛黄与人工牛黄的性味、色泽、理化特性、药效成分之间无明显差异[4]。人工牛黄是牛胆汁酸、胆红素与无机盐(硫酸镁、硫酸亚铁和磷酸三钙)、胆固醇、淀粉等原料混合而成。人工牛黄显金黄色或浅棕黄色，质轻，大多为疏松粉末，也有因制法不同而呈方形或球形，水溶后可染指甲为黄色，味苦而微甜，入口后无清凉，感气略腥而微清香[5]。

2.2 薄层鉴别相关研究指出[6]，牛黄中含量最高的是胆红素，其次为胆汁酸、胆酸、去氧胆酸、胆汁酸盐、胆固醇等，还含有微量元素、类肽的平滑肌收缩成分、胡萝卜素类物质、氨基酸。人工培植牛黄与天然牛黄在胆汁酸、胆酸的含量有差异[7]。叶蓓蓓[8]以胆酸提取样品，使用薄层扫描法测定了胆汁酸的含量，与天然牛黄进行区分。还有研究者认为牛黄质量控制的最佳方法是利用薄层扫描仪对不同浓度的胆酸薄层指纹图谱进行扫描，并测定胆酸的含量，得出胆酸的指纹特征图谱。薄层色谱建立的指纹特征图谱能准确、快速地进行含量测定，可用于人工牛黄中胆酸的定量分析研究。薄层鉴别方法操作简单，但是鉴别准确度不高。

2.3 重氮化比色法和水性溶剂法由于形成环境、培育方法等因素的不同，天然牛黄与人工培育牛黄在胆红素的含量上可能有差异。胆红素的传统测定方法有水性溶剂法和重氮化比色法。重氮化比色法测定胆红素含量是在520 nm波长处测定胆红素与重氮化试剂发生偶联反应生成的偶氮染料的吸光度。水性溶剂法通过添加反应促进剂测胆红素的溶解度，以得到更加准确的胆红素含量测定值[9]。

2.4 高效液相色谱法高效液相色谱法具有准确度与重现性较高的特点，能较好地控制牛黄及其代用品的质量。夏晶等[10]使用高效液相-紫外吸收法比对天然牛黄和体外培育牛黄中胆红素的含量，发现体外培育牛黄中没有游离胆红素而天然牛黄中有少量游离胆红素；体外培育牛黄中结合胆红素的含量较高而牛黄中以共价胆红素为主，以此可明显鉴别牛黄及其代用品。但是高效液相-紫外吸收法操作比较繁琐，影响因素较多，鉴别准确度不高。与高效液相-紫外吸收法不同，高效液相-蒸发光散射法是一种质量型通用检测器，对牛黄中无紫外吸收的胆汁酸分析检测显示出了极大的优越性。李珂等[11]对10批天然牛黄和10批体外培育牛黄使用高效液相-蒸发光散射法测定胆固醇含量，并进行比对，发现可能因产地、来源等不同，牛黄与体外培育牛黄中胆固醇的含量有差异，且体外培育牛黄因制备工艺稳定其胆固醇含量差异较小。牛黄中胆汁酸种类复杂，且一部分胆汁酸含量很低，不容易检测得到，高效液相色谱-质谱联用法(HPLC-MS)选择性和灵敏度高，可以较好地分离牛黄中的胆汁酸成分。雷凯等[12]通过三重四极杆质谱检测器法测定牛黄及代用品中的多种胆汁酸和胆红素成分的含量，发现培育牛黄和牛黄中结合型胆汁酸的含量比例存在明显差异，且猪去氧胆酸是人工牛黄独特的成分。

2.5 近红外光谱法近红外光谱能够反映样品中化学成分的全貌，研究对象的分类通过结合模式识别技术实现。目前已经有一些研究将近红外光谱法应用于牛黄及其代用品的鉴别上。阳志云等[13]的人工牛黄的真伪鉴别模型是基于欧氏距离建立。艾莉等[14]运用聚类分析分别分析人工牛黄的正品与伪品，发现正品与伪品牛黄各聚为一类，2类之间的界限明显。伪品人工牛黄可通过近红外光谱分析技术进行鉴别，与理化方法鉴别结果一致，并且具有无损、快速、准确的优点。牛黄及其伪品的近红外光谱原始吸收模式相似,吸收峰位置和相对强度不同是其主要差别。不同种类牛黄样品的化学组成可以通过近红外光谱进行反映。光谱的相似性导致天然牛黄的鉴别必须依靠化学模式识别方法在光谱数据中提取相关化学信息才能实现。徐璐等[15]将基于偏小二乘回归的类模型方法应用于天然牛黄、人工牛黄掺伪品的鉴别分类上，准确度高达100%。聂黎行等[16]比较天然牛黄、人工牛黄和体外培育牛黄的近红外漫反射光谱差异，利用主成分分析法观察不同样品主成分空间分布，结果发现其主成分空间分布明显不同，天然牛黄、体外培育牛黄和人工牛黄各自单独聚为一类，预测准确率高达100%。近红外光谱技术无样品破坏，无人为主观因素的影响，无环境污染，不消耗化学试剂，牛黄等贵细中药的分析与鉴别尤其适用。而传统感官指标数字化、准确、快速、简便、客观等是引入模式识别技术的优点。

2.6 氨基酸自动分析仪法张启明等[17]测定并分析牛黄及代用品中含有的氨基酸，发现培植牛黄中的氨基酸总量明显多于天然牛黄(天然牛黄中游离氨基酸只有万分之几至千分之几)。

3 小结与展望

牛黄及其代用品化学成分复杂，经过查阅与总结文献，人工牛黄中含有猪去氧胆酸和少量游离胆红素，这点与天然牛黄、体外培育牛黄、体内培育牛黄相区别。牛黄中结合胆红素比例明显偏低，牛黄中的共价胆红素显著高于体外培育牛黄，而且体外培育牛黄不含有游离胆红素，鉴别牛黄及其代用品可通过不同类型的胆红素含量比例进行。因药材市场上牛黄掺伪技术逐步增强，仅仅测定胆汁酸、胆红素等成分的含量差异不能准确鉴别与区分在牛黄正品中掺入其他代用品。找到牛黄和体外培育牛黄各自的专属性意义特征成分，随之建立专属性检测，能使牛黄类中药材成药掺伪造假问题得到有效解决。目前这类多指标检测、指纹图谱检测研究相对较少，亟待研究者进一步深入探讨。