秸秆还田对半干旱区玉米农田土壤细菌群落结构的影响

孙孟琪，刘浩然，刘小丹，王洪君，王 楠，高 阳，栾天浩，王立春，陈宝玉

(1.吉林省农业科学院农业资源与环境研究所，农业农村部东北植物营养与农业环境重点实验室，吉林 长春 130033；2.吉林农业大学资源与环境学院，吉林 长春 130118；3.白城市农业机械化技术推广站，吉林 白城 137000)

土壤微生物是农田生态系统的重要组成部分，在土壤有机质形成和转化、土壤养分循环等方面发挥着至关重要的作用[1].同时，土壤微生物群落组成及活性变化是衡量土壤质量和肥力的一个关键性指标[2]，而细菌作为土壤微生物中的重要类群，其多样性以及群落结构的变化更能够反映土壤的质量状况[3].农田生态系统在耕作措施和有机物料的输入改变土壤理化性质的同时，对土壤微生物多样性及群落结构也产生了不同的影响[4].研究不同秸秆还田方式下土壤微生物多样性及群落结构演替规律，对选择合理的种植措施和改善土壤生态功能具有重要意义.

淡黑钙土为吉林省西部的主要土壤类型，其主要特征为腐殖质积累过程弱、含量低，因此其肥力效果相对较差[5].作为少数可受人为调控的农田土壤培肥方式，秸秆还田越发受到重视.目前，秸秆还田也是该区域提升地力的有效手段之一，是土壤有机碳和养分的重要来源[6].大量研究表明，玉米秸秆还田可有效改善土壤有机质下降以及养分过量消耗等问题，有助于提升土壤肥力、增加作物产量[7-8].特别是作物秸秆还田后，可供微生物生命活动的有机物显著增加，促进了土壤微生物(真菌、细菌等)的代谢繁殖.陆思旭等[9]研究发现，渭北地区旱地农田土壤有机碳是影响微生物碳源代谢的主要因素，而免耕、深松、隔年轮耕为该区域适宜的耕作措施.李景等[10]对豫西保护性耕作土壤的研究发现，免耕、深松覆盖可改善土壤团聚体的状况，提高土壤微生物的多样性指数.但针对吉林省西部半干旱区耕作措施对玉米农田土壤微生态系统的影响尚缺乏认识，土壤微生物与生态环境间的响应机制仍需探讨.

本研究针对不同玉米秸秆还田方式下，玉米农田土壤化学性质及酶活性变化特征，利用Illumina Miseq高通量测序技术，揭示了土壤微生物多样性、群落结构分布规律及其与关键环境因子间的关系，为进一步探明土壤微生物对不同秸秆还田方式的响应机制以及建立适宜该区域的耕作制度提供了理论支撑与参考依据.

1 材料与方法

1.1 研究区域概况

大田试验的地点位于吉林省白城市洮北区青山镇生产村(N45°69′，E122°86′).研究区属温带大陆性季风气候，年平均降水量为399.9 mm，年平均气温5.2℃，≥10℃活动积温平均为2 996.2℃，无霜期平均为144 d，年平均日照时数为2 915 h.土壤类型为淡黑钙土，基础理化性质为：土壤全氮含量1.04 g/kg，土壤全磷含量0.31 g/kg，土壤全钾含量24.79 g/kg，土壤有机质含量20.00 g/kg，pH=6.40.

1.2 试验设计

试验布设从2018年开始，连续耕作两年.试验采用秸秆全量还田方式，共设置4个处理：传统耕作(NT，秸秆不还田+常规种植，作为对照CK)；覆盖+秸秆还田(CS)；旋耕+秸秆还田(RS)；旋耕-覆盖(CRS，第一年覆盖+第二年旋耕)轮耕处理.采用小区试验，设3次重复.每年各处理均于4月末播种，9月末收获，常规田间管理.种植品种为翔玉998，播种密度70 000株/hm2，播种前施用复合肥(m(N)∶m(P2O5)∶m(K2O)=28∶12∶14)作为基肥.

1.3 样本采集与处理

为了评价连续两个耕作季之后的土壤状况，于2019年9月下旬玉米收获后，在各处理样地内随机取样.每个处理设5个土壤采样点，去除土壤表层植株，采集0～20 cm土壤样品，用无菌袋收集.将每个处理所有样品除去土壤中的根系、碎石及其他杂物，充分混匀后分成3份用于微生物多样性研究.土壤样本在冻存状态下寄送上海美吉生物医药科技有限公司进行测序.用于土壤酶活测定的样品4℃保存，风干样品用于测定土壤理化性质.

1.4 土壤化学性质及酶活性指标测定

土壤pH值及养分(有机质、全氮、全磷、全钾、有效氮、速效磷以及速效钾)含量采用常规方法进行测定.土壤脲酶活性采用苯酚-次氯酸钠比色法进行测定，土壤磷酸酶活性采用磷酸苯二钠比色法进行测定，蔗糖酶活性采用3，5-二硝基水杨酸比色法进行测定[11-12].

1.5 PCR扩增及测序

利用 E.Z.N.A.© soil DNA Kit (Omega Bio-tek，Norcross，GA，U.S.)土壤试剂盒对供试样品进行土壤微生物总 DNA 的提取，采用细菌16S rRNA扩增引物338F (5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′) 和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′) V3-V4高变区进行PCR扩增，进一步纯化后进行双端测序.PCR 反应条件为：95℃初变性3 min；95℃变性 30 s，55℃退火 30 min，72℃ 45 s，35个循环；72℃延伸 10 min；4℃保温.采用Illumina MiSeq PE300平台(San Diego，CA，USA)进行测序.原始测序序列使用Trimmlmatic软件进行质控，使用FLASH软件进行拼接后去除质控后长度低于50 bp的序列；去除模糊碱基；根据重叠碱基overlap将两端序列进行拼接.使用Uparse v7.1 (version 7.1 http：∥drive5.com/uparse/)软件[13]对有效数据在97%相似度水平的OTU代表序列进行聚类分析；使用UCHIME软件剔除嵌合体.基于Silva (SSU123) 16S rRNA数据库，采用RDP分类算法(http：∥rdp.cme.msu.edu/)对每个16S rRNA基因序列进行分类分析，置信阈值为70%.根据测序结果分析各个水平上统计样品的群落结构.

1.6 数据处理

土壤化学性质及酶活性数据利用DPS及Microsoft Excel 2017软件进行完全随机分析.测序数据利用Mothur软件[14]对序列进行抽平，并计算Shannon，Simpson多样性指数和Chao1丰富度指数.利用R(v.4.0.3)软件(R Development CoreTeam，2006) 对不同耕作条件下细菌群落结构组成的变化特征和其主要驱动因子进行热图(heatmap)、非度量多维尺度和聚类分析.

2 结果与分析

2.1 不同处理土壤化学性质的比较

不同处理土壤化学性质的结果见表1.由表1可见，与CK相比各处理土壤养分含量均存在差异.各处理pH均为中性，且变化并不显著，其中RS处理土壤pH最低、CRS则最高.从水解性氮含量来看，CS处理模式为最高，较CK提升了38.47%，而RS和CRS处理较CK分别提升了15.39%和7.70%.CS模式显著提升了土壤有机质含量，较CK提升32.08%，而CRS处理却降低了12.5%.综合分析结果，不同秸秆还田处理中，CS处理对土壤全氮/磷/钾、速效钾、有效氮及有机质含量均具有明显的提升作用；CRS处理模式则不同程度降低了相关指标.

表1 不同还田方式下土壤化学性质

已有的研究表明，秸秆以不同方式还于土壤(覆盖、旋混)，使其被微生物分解的机会大大增加，可促进土壤养分积累；秸秆在腐解的过程中，也会激活土壤中氮、磷和钾等养分，进而提高速效性养分[15-17].本研究中，旋混还田和免耕覆盖还田方式不但有效增加了土壤有机碳含量，还改善了土壤pH，有利于植物生长；对比不同处理方式，免耕覆盖秸秆还田模式对土壤养分总体提升更为显著.

2.2 不同处理对土壤酶活性的影响

由表2可见，不同耕作措施结合秸秆还田后，均不同程度地改变了土壤的活性.在土壤蔗糖酶活性方面，CK处理为最高，其次为CS处理，CRS处理为最低；CS处理较CK略有降低，但未达到显著水平.土壤脲酶活性则为CS处理最高，较CK处理提升了29.28%，RS次之；CRS处理活性最低，较CK降低5.88%.土壤酸性磷酸酶活性分析结果显示，RS>CS>CK>CRS；RS处理较CK活性提升了31.33%，CS提升了20.62%.对比3种方式，CS、RS两个处理均能够显著提高土壤脲酶酸性磷酸酶活性，轮耕模式(CRS)则极显著降低了蔗糖酶活性，同时脲酶和酸性磷酸酶活性也大大下降.

表2 不同处理土壤酶活性 U/g

土壤酶活性与土壤化学性质、养分含量和耕作方式有着紧密的联系，也是评价土壤肥力的关键因素[18-20].秸秆还田后，可以增加土壤氮和碳的供应，从而导致脲酶和蔗糖酶活性均相应改变.本研究中，不同秸秆还田方式下，免耕覆盖还田和旋混还田均显著提高了土壤蔗糖酶及脲酶活性，这主要是由于外源有机碳(秸秆)的添加，带来了新的养分，通过微生物作用固存到土壤中.而轮耕模式则使酶活均呈下降趋势，这主要是由于耕作方式的改变，导致土壤物理性状发生改变，进一步改变了土壤水、热、气的综合作用效果，使整体酶活性较常规种植降低.

2.3 不同处理对微生物多样性的影响

通过16SrRNA基因高通量测序，在97%相似度下降序列聚类分析物种分类单元(OTU)，统计各OTU在不同样品中的丰度信息并进行α-多样性分析[21-23]，结果见表3.其中：Sobs指数是指实际观测到的OTU数目；Shannon指数和Simpson指数主要用来衡量物种的多样性情况；Chao1指数主要用来衡量物种的丰富度；Coverage指数主要用来检测测序对物种的覆盖度.根据多样性指数可以看出，所有样品的覆盖度均在95%以上，说明取样合理，所测结果有效可靠，可真实反映不同处理条件下土壤中的细菌群落组成[24-25].由表3可以看出，Shannon以及Chao1指数为CK>CRS>RS>CS，说明秸秆还田下的3种耕作方式(CS、RS、CRS)土壤群落物种多样性均略低于常规种植(CK)方式.而Simpson指数在4种耕作条件下变化较低，说明秸秆还田耕作方式对细菌的均匀性起到的作用有限.通过秸秆还田结合免耕覆盖、旋混旋耕等耕作措施，土壤的Shannon和Chao1指数均低于传统耕作，而Simpson指数变化有限.这个结果侧面说明本研究所设3种耕作措施可在一定程度上富集可分解秸秆的特定微生物种群，导致整体微生物群落发生改变.

表3 不同处理土壤细菌多样性指数

2.4 不同秸秆还田方式对土壤细菌群落的影响

2.3.1 土壤细菌纲水平上的比较

各处理土壤细菌群落在纲水平上占主要数量的优势物种基本相同，前4位纲分别为Alphaproteobacteria(15.84%～20.64%)，Actinobacteria(11.15%～14.95%)，Gammaproteobacteria(12.39%～14.09%)以及Blastocatellia Subgroup_4(8.26%～12.24%) (见图1).与CK(NT)比较发现，在纲水平上，所占比率较低的Bacteroidia(CK 4.70%，其他5.30%±0.35%)、Saccharimonadia(CK 1.16%，其他2.71%±1.18%)、Verrucomicrobiae(CK 2.08%，其他2.56%±0.33%)占比一致增加，而Holophagae (CK 1.18%，其他0.56%±0.11%)占比一致减少，说明耕作措施以及秸秆还田对土壤细菌群落在纲水平上有一定影响.Holophagae在CK中所占比率分别高于RS 2.84倍和CRS 2.04倍，Acidobacteriia在CK中所占比率分别低于RS 0.59倍和CRS 0.52倍，说明这两种纲受到旋混耕作措施的影响显著.然而，Saccharimonadia在CS和RS中所占比率分别低于CK处理0.44倍和0.28倍，说明Saccharimonadia对不同秸秆还田方式的响应更为显著.

图1 不同处理样本纲水平细菌群落组成

2.3.2 土壤细菌科水平上的比较

在科分类水平上，共检测到土壤细菌362科，其中，CK有324科，CS有309 科，RS和CRS有302科.进一步对任意一个样品丰度高于1.0%的物种在科水平进行热图(heatmap)分析，结果(见图2)表明，前3种丰度最高的科为Pyrinomonadaceae(CK 9.38%，CS 8.73%，RS 5.72%，CRS 7.88%)，Sphingomonadaceae(CK 8.04%，CS 7.24%，RS 9.76%，CRS 7.54%)以及Acidobacteria Subgroup_6(CK 7.69%，CS 9.33%，RS 5.22%，CRS 6.30%)，在不同处理的土壤细菌群落所占比率为20.69%～25.31%.与CK比较，Pyrinomonadaceae，Burkholderiaceae，Holophagae Subgroup_7，Actinobacteria IMCC26256，Xanthomonadaceae等5科通过秸秆覆盖还田、旋混还田等处理措施之后丰度一致减少，而Solibacteraceae，Blastocatellaceae，Rhodanobacteraceae，Saccharimonadales，Pedosphaeraceae，Rhizobiaceae，Micropepsaceae丰度一致增加.此外，与CK相比较，Acidobacteria Subgroup_6和Xanthobacteraceae仅在旋混还田处理中分别增加了32%和30%，而Rokubacteriales减少了51%.这些结果说明本研究中所设的3种不同秸秆还田结合耕作措施处理显著改变了土壤细菌的群落结构.

图2 不同处理样本科水平丰度前30的群落热图(heatmap)

已有研究表明，Rhodanobacteraceae细菌可以利用不同的碳基作为碳源，而Saccharimonadales细菌可促进植物自身及其衍生有机物的降解.此外，Blastocatellaceae细菌与聚合物的碳代谢有关.由于秸秆还田可直接增加各处理土壤的有机物含量，而这些有机物可被微生物降解，进而使有机质及养分等物质在秸秆还田的土壤中较常规种植土壤增加.

2.4 细菌群落结构变化与环境因子的关系

基于各OTU的Bray-curtis聚类图谱分析(见图3)表明，在OTU水平上4种不同耕作处理间细菌群落结构差异显著(最大差异为30%).与常规耕作比较，OTU水平上群落结构变化为CRS>RS>CS，说明土壤中细菌群落结构受到耕作措施的影响较大.

图3 不同处理样本细菌群落聚类分析

利用非度量多维尺度分析和聚类 (NMDS)结合环境因子进行的相关性分析(见图4)发现，土壤中pH、速钾、全氮、有机质含量以及土壤脲酶是细菌群落结构发生变化的主要驱动因子(P<0.01)，其中，土壤中有机质和全氮含量对细菌群落结构变化贡献度最大.

3 结论

本研究针对吉林省西部半干旱区典型淡黑钙土地区农田土壤，采用高通量测序方法，对不同耕作措施结合秸秆还田后土壤养分变化、土壤酶活性、微生物多样性及群落结构特征进行了研究，结果表明：(1)秸秆覆盖还田与旋混还田均可提高土壤中氮、磷、钾以及有机质含量并降低土壤pH；(2)秸秆覆盖还田与旋混还田均能够有效地富集 Rhodanobacteraceae，Saccharimonadales，Solibacteraceae，Blastocatellaceae细菌；(3)pH、速钾、全氮、有机质含量以及土壤脲酶活性是细菌群落结构发生变化的主要驱动因子(P<0.01).以上研究为进一步探明土壤微生态对秸秆还田的响应机制，以及建立适宜吉林省西部半干旱区农田的秸秆还田模式提供了理论支撑与科学依据.