NRG1对七氟醚麻醉致认知功能障碍保护作用的研究

翁洪亮，李兴达，李凤利，王明敬，徐以燕

(临沂市中心医院，山东 临沂 276400)

0 引言

术后认知功能障碍主要是指麻醉后患者定向力、抽象思维、记忆力等功能出现障碍，部分患者还可伴有社会活动减退现象，直接影响其社交能力，成为围术期最为多见的中枢神经系统的并发症[1]。其中七氟醚属于临床常用的吸入型麻醉药物，其安全性已被临床公认，且手术期间可稳定患者的血流动力学，并减低肌松药物的剂量，促进患者尽快苏醒[2]。但随着七氟醚的广泛运用，临床关于患者麻醉后躁动以及认知功能障碍发生率较多的报道随之增多，但七氟醚可对神经系统发挥保护功效，但临床学者关于其对认知能力的影响仍存在较大争议[3-4]。随后临床发现NRG1(神经调节蛋白1)对七氟醚麻醉致认知功能障碍的保护作用存在一定影响，但目前相关报道较少，本文对此展开实验，阐述如下。

1 资料与方法

1.1 动物与分组

选择清洁级成年的30 只SD 大鼠，依据随机双盲法分成三组各10 只，其中正常组：大鼠仅仅尾静脉注射生理盐水；模型组：3%七氟醚麻醉大鼠；NRG1 组：大鼠尾静脉注射10μg/kg 的NRG1，持续一周。

1.2 方法

创建认知功能障碍大鼠模型：麻醉前，大鼠禁饮禁食，放入透明麻醉吸入箱进行吸入麻醉，将麻醉箱一侧孔与麻醉机(德国Drager 公司，DragerFabius 型)连接，另一侧孔与多功能监测仪(美国GE 公司，solar8000M 型)相连，密切关注流出气体的麻醉浓度。所有大鼠给予1.5%异氟醚，维持性吸入2h，使麻醉箱维持30%氧浓度。麻醉手术组大鼠在吸入箱内接受麻醉后，快速转移至预充相同气体以及吸入麻醉药的大鼠面罩内，实施麻醉与手术，对其右侧股动脉进行插管，并连接多功能监护仪，清除腹部皮肤毛发，常规消毒后，给予腹正中切口，执行腹腔探查术，分别检查其肠道、肝、肾等重要器官，手术时长2h 左右。术中密切关注大鼠动脉血压、心率等体征，并提供腹腔加温生理盐水滴注补液及保温处理。分别在术中0.5h、1h、2h 收集其动脉血实施血气分析。术中严格遵守无菌操作，术后选择青霉素钠50u/g 进行腹腔注射，1 次/d，预防感染，等待伤口完全愈合、拆线。

Morris 水迷宫实验：水迷宫直径设置成130 cm，深度30 cm，水温度23℃左右，平台高28 cm，置于第Ⅳ象限。实验前24h 将大鼠投入水中，使其适应实验环境条件。整个实验期间水迷宫外的参照物均维持不变，且要求操作者每次实验均站在同一位置，实验时长7d。

定位定航实验：将大鼠从不同象限面向池壁放入水中，观察其在120 s 内寻找平台的时长，即是逃避潜伏期。若大鼠120 s内未寻找到平台，潜伏期计成120s。所有大鼠反复3 次，每次间隔30 s，最后统计平均值。空间探索实验：实验第7d，撤走平台，随意选择一个象限将大鼠放入水中，观察大鼠120s 内游泳的轨迹。

实验第7d 后，各组大鼠均经股动脉放血，放在室温下自然凝固，随后以2500 r/min 进行离心操作，时间控制在10 min，收集血清，放在-80℃冰箱保存备用。将放血休克后的大鼠快速断头取脑，置于冰上，利用弯眼科镊将脑组织正中失状缝位置左右皮质打开，得到海马组织，放入EP 管内，存放在-80℃冰箱保存备用。

1.3 观察指标

选择4%多聚甲醛妥善固定海马组织，时间24h，分别选择95%、85%、75%酒精依次脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，苏木精染色，自来水清洗，选择1%盐酸酒精分化，伊红复染，最后梯度酒精脱水，二甲苯透明，利用中性树脂固定，选择光学显微镜，仔细观察海马组织病理变化。

利用ELISA 法测定大鼠海马组织中Aβ(β淀粉样蛋白)及APP 的表达，选择100μg 海马组织，分别加入蛋白酶抑制剂、烷基硫酸钠，裂解匀浆，置于4℃条件下，以12000 r/min 离心，时间10 min，取上清液，严格遵照Aβ及APP 试剂盒说明书进行测定。

利用实时荧光定量PCR 法测定Aβ及APP mRNA 的表达，依据trizol 试剂盒要求提取肺组织中总RNA，并检测总RNA纯度，将获得的RNA 利用逆转录试剂盒合成CDNA，最后利用Realtime PCR 扩增，其结果选择2-ΔΔCt 法分析。

western blot 法测定Aβ及APP 蛋白表达，匀浆肺组织，加入适量RIPA 裂解液，离心操作后收集上清液，得到总蛋白。按照BCA 试剂盒说明书要求检测蛋白浓度。蛋白上样，实施凝胶电泳，后湿法转PVDF 膜。一抗溶液孵育，4℃过夜；二抗溶液中室温孵育1-2 h。取膜漂洗，加入ECL 曝光液，在凝胶成像系统中曝光。

表1 三组Morris 水迷宫实验结果的对比

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 三组Morris 水迷宫实验结果的对比

NRG1 组的游泳速度、逃避潜伏期、穿越平台次数、停留时长、游泳距离与其他三组相比差异显著(P＜0.05)。见表1。

2.2 三组NRG1、Aβ 以及APP mRNA 的对比

NRG1 组的NRG1、Aβ、APP mRNA 与其他三组相比差异显著(P＜0.05)。见表2。

表2 三组NRG1、Aβ 以及APP mRNA 的对比

3 讨论

术后认知功能障碍作为麻醉后极为常见的严重并发症，临床症状以记忆力降低、注意力不集中、精神错落等现象为主，部分患者可维持数周甚至数年，直接影响患者的日常生活以及机体健康[5]。一旦出现后，可延长患者治疗周期以及住院时长，不仅给患者机体健康带来危害，同时可能增加家庭经济负担，受到医疗界重点关注[6]。

临床经研究发现[7]，年龄、手术、麻醉以及患者身体状况等因素均是引发术后认知功能障碍的主要原因，尤其是在全身麻醉中，其麻醉药物可对患者大脑意识、学习记忆能力造成不同程度的抑制，才可满足手术需要的麻醉深度，但术后药物的清除程度可能难以快速促进患者大脑神经功能恢复，甚至可能造成β淀粉样堆积，促进神经元凋亡。Xiong 等学者曾开展实验[8]，选择小鼠作为观察对象，分别给予七氟醚麻醉进行干预，结果发现其出现显著的认知缺陷，经分析发现七氟醚能够对NGF 进行干扰，使胆碱能变性，进而引发认知功能障碍。而认知功能障碍的病理特征以Aβ水平升高为主，而NRG1 作为神经分裂症上的易感基因，尤其是在癫痫或者阿尔兹海默病等精神疾病上，可发挥一定的神经保护效果，因此临床推测其对麻醉造成的认知功能障碍也存在保护作用，同时可抑制Aβ表达，但尚未有相关报道证实[9]。本文对此展开实验，从结果中看到：NRG1组的游泳速度、逃避潜伏期、穿越平台次数、停留时长、游泳距离与其他三组相比差异显著(P＜0.05)。NRG1 组的NRG1、Aβ、APP mRNA 与其他三组相比差异显著(P＜0.05)，提示NRG1 组水迷宫检查结果更优，同时可改善NRG1、Aβ、APP mRNA 表达水平。其中Aβ作为认知功能障碍中常见的标志物，其与神经功能损害存在一定相关性，而手术、麻醉、炎症反应等均可直接影响机体中Aβ的代谢，促进其生成，因此Aβ在认知功能障碍的发生中具有重要意义。Yu 等学者[10]曾选择胃部手术患者作为观察对象，对比术后认知功能障碍者与未发生者的血清Aβ水平，发现前者水平更高于后者，进一步证实了发现随着Aβ水平的增加，患者神经功能的损伤随之加重，甚至引发认知功能障碍。而NRG1 作为表皮生长因子蛋白，可刺激ErbB 受体酪氨酸激酶，进而控制神经递质传导，直接影响大脑生理功能、中枢神经系统发育。由于NRG1 中具备表皮生长因子样核心基团，可促进轴突生长、神经元迁移、突触产生。另外海马以及皮层的神经活动与大脑学习记忆存在密切关联性，因此NRG1 可控制多类神经递质产生，并在海马神经以及皮层网络活动上具备重要意义，最终影响大脑记忆能力[11]。从本文研究结果中看到，NRG1 不仅能够对鼠神经进行保护，同时还可改善认知功能障碍现象，其机制与抑制Aβ堆积有关。

综上所述，NRG1 运用于七氟醚麻醉认知功能障碍中效果突出，对认知功能进行保护，为后续临床防治提供指导价值。