类风湿关节炎中的外泌体及其作用研究进展

孙 勇 赵 创 刘志丹

1.上海中医药大学附属曙光医院宝山分院康复医学科，上海 201999；2.上海市宝山区中西医结合医院康复医学科，上海 201999；3.上海中医药大学附属曙光医院宝山分院针灸科，上海 201999

近些年来，外泌体越来越受到研究者们的关注。最初，它们被认为是无用的细胞代谢废物，但在随后的研究中逐渐发现外泌体能通过转移蛋白、脂质、编码RNA、非编码RNA 等物质至靶细胞或分子发挥作用。对于类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）而言，外泌体既可以是致病原因，也可以是疾病的生物标志物，还可以是治病的工具和手段。本文就这几方面问题进行了回顾和梳理。

1 RA 的生物标志物

近年研究发现：外泌体的内容物包括核酸、蛋白质、各种微RNA（microRNA，miRNA）、DNA 及多种脂质物质，例如神经酰胺、鞘磷脂-髓磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺和胆固醇等。外泌体携带的一部分内容能反映亲代细胞的生理或病理状况[1]，因此外泌体可作为疾病诊断的生物标志物。

研究显示，RA 中外泌体来源的miR-424[2]、miR-221-3p[3]、miR-223-3p[4]高表达，miR-548a-3p[5]、miR-1915-3p[6]低表达，均可作为本病的潜在标志物。RA患者血液单核细胞和血清外泌体中同源框转录反义RNA（homehox transcript antisense RNA，HOTAIR）高表达[7]，导致活跃的巨噬细胞迁移；相反，在分化的破骨细胞和滑膜细胞中检测到显著较低水平的HOTAIR。蛋白质质谱分析[8]在活动性RA 患者中鉴定出的Toll 样受体3 则呈现异常的高表达，提示RA 血清外泌体中含炎症相关蛋白，在RA 发病过程中有重要作用。

2 促炎作用

2.1 分泌促炎性细胞因子

机体的炎症过程受致炎和抑炎细胞的动态平衡调节。外泌体介导了细胞与细胞间交流，促进了炎症因子的分泌，从而引起了炎症的发生。

研究显示，RA 患者体内的外泌体可抑制CD8+T细胞、B 细胞、自然杀伤细胞的增殖，促进Treg 细胞的分化，抵御巨噬细胞引起的炎症反应，促进Th1细胞的增殖[9]。血小板来源的外泌体[10]和胶原蛋白、胶体蛋白相互作用后可以表达白细胞介素（interleukin，IL）-1，从而导致成纤维样滑膜细胞（fibroblast-like synoviocyte，FLS）释放的IL-6 和IL-8 增加。PEV 进入发炎关节后，其磷脂膜被转化成促炎介质12 羟基二十碳四烯酸，再次加剧炎症。同时，外泌体将血小板磷脂膜释放的花生四烯酸运输到血小板和内皮细胞，从而诱导环氧化酶2 和凝血素A2 的生成，同时活化血小板、促进合成前列腺环素-2，进一步加重RA 进程。RA 患者滑膜液和滑膜成纤维细胞的外泌体中含有大量的DNA 结合/分化抑制因子1，它能促进成纤维细胞增生、抑制IL-6 和IL-8 的分泌，参与RA 的发病机制[11]。

2.2 表达特殊的膜蛋白

在过去的20 年里，大多数外泌体的研究都集中在核酸组成和邻近细胞转移。然而，外泌体也携带特殊的膜蛋白，可以识别其亲代细胞的生理和病理状态。有研究[12]显示：膜结合形式的肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α 存在于RA 患者滑膜成纤维细胞外泌体中，而在骨关节炎患者滑膜成纤维细胞外泌体中未见膜结合形式的TNF-α。RA 滑膜成纤维细胞外泌体被抗CD3 激活的T 细胞有效地吸收，激活蛋白激酶和核因子κB，诱导胶原酶-1 产生，从而促进炎症，并使这些活化的T 细胞具有抗凋亡的能力。

2.3 释放促炎miRNA

miRNA 不仅存在于细胞内发挥着生物学功能，也存在于细胞分泌的外泌体中；细胞内的miRNA 也可以跟随外泌体的释放进入或影响其他细胞，从而发挥生物学功能。

例如：外泌体来源的miR-21 和miR-29a 能够通过与这些细胞中的Toll 样受体7 相互作用激活小胶质细胞、巨噬细胞和神经元，从而导致促炎性细胞因子如TNF-α 和IL-6 的分泌，加重RA 炎症[13]；树突状细胞来源的外泌体miR-155 及miR-146a 可介导FLS 与其他免疫细胞间的信息交流与物质交换，从而调控RA 的疾病进程[14]；巨噬细胞和FLS 释放含有miR-let-7b 的外泌体，进入发炎关节的髓样细胞连接Toll样受体后，诱导髓样细胞分化为M1 巨噬细胞，进而释放TNF、IL-1、IL-6 等一些促炎性细胞因子，加重RA 关节炎症[15]；外泌体携带的miR-17通过抑制转化生长因子受体Ⅱ表达来抑制Treg 细胞的分化，促进RA 的发展[16]。

3 骨破坏作用

骨代谢是一个机体中破骨效应和成骨效应此消彼长的过程。RA 中的骨破坏作用主要体现在软骨组织的破坏、破骨细胞的增多从而影响骨形成和促进骨吸收两方面。

破骨效应方面，有研究[17]显示，RA 机体中软骨组织和软骨细胞中丙酮酸脱氢酶激酶4（pyruvate dehydrogenase kinase 4，PDK4）低表达，miR-106b 是PDK4的上游调控因子，且在RA 滑膜成纤维细胞和滑膜成纤维细胞衍生的外泌体中高表达。miR-106b通过外泌体从SFs 传递到软骨细胞，抑制软骨细胞增殖和迁移，加速细胞凋亡，并通过下调PDK4 影响核因子κB配体/RANK/骨保护素系统。

在骨形成和吸收方面，据报道[18]，破骨细胞miR-214-3p 的增加与老年骨折女性血清miR-214-3p 升高及卵巢切除小鼠的骨形成减少有关，靶向抑制破骨细胞miR-214-3p 可促进老龄卵巢切除大鼠的骨形成。表明含有miR-214 的破骨细胞衍生外泌体能抑制成骨细胞活性，在破骨细胞中抑制miR-214-3p可能是治疗诸多骨形成减少的骨骼疾病的一种策略。

4 抑炎作用

除了上述促炎作用，外泌体及其衍生物在不同环境条件下，还可能起抑炎作用。

首先，一部分外泌体可分泌miRNA 抑制炎症。例如：含有miR-150-5p 的间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）衍生的外泌体能下调基质金属蛋白酶14 和血管内皮生长因子的表达，通过下调滑膜细胞增殖和血管生成来减少关节破坏[19]；miR-320a 的MSC 源性外泌体显著抑制RA-FLS 的激活、迁移和侵袭，并减轻胶原诱导的关节炎（collagen-induced arthritis，CIA）小鼠的关节炎和骨损伤[20]；RA 患者的血清外泌体中miR-6089 显著降低，而miR-6089 可抑制炎症细胞因子如IL-6、IL-29 和TNF-α 的分泌，间接介导了炎症反应[21]；外泌体来源的miR-192-5p 可通过靶向RAC2 在体外抑制炎症和减轻RA 症状[22]。

另外，部分外泌体本身能抑制炎症因子或效应性T 细胞。例如：MSCs 来源的外泌体可以抑制CD4+和CD8+T 细胞的增殖，可在迟发型过敏小鼠模型中发挥抗炎效应，同样在CIA 模型中也能减缓炎症[23]；来自转化生长因子基因修饰的树突状细胞的免疫抑制性外泌体能够减弱小鼠Th17 介导的炎症[24]，全身注射该类型外泌体是一种有效的治疗，有研究已建立的鼠类CIA 治疗方法[25]；来自人MSC 的外泌体对T 细胞分化和激活具有抑制作用，并能减少γ 干扰素释放[26]，对适应性免疫和先天性免疫均具有抑制和调节作用，从而促进关节组织修复。

5 软骨修复作用

RA 的主要特征是关节滑膜的炎症和软骨、骨进行性破坏，如果能有效阻止骨破坏、促进软骨修复，则将有益于RA 的转归。

RA-FLS 衍生的外泌体中miR-486-5p 靶向Tob1，并激活成骨细胞中的BMP/Smad信号通路，促进成骨细胞分化。含有miR-486-5p 的RA-FLS 衍生的外泌体通过降低CIA 诱导的小鼠中的Tob1 表达来减轻RA 的骨质破坏[27]。

大鼠股骨远端滑车沟的软骨缺损处注射人胚胎MSC 来源的外泌体可以完全修复软骨及软骨下骨[28]，恢复透明软骨良好的表面规则性，使其与邻近软骨完全结合。这说明该外泌体作为一种现成的、无细胞的治疗方法可以替代基于细胞的MSC 治疗。

使用患者脂肪干细胞（adipose-derived stem cell，ADSC）分离外泌体与活化的滑膜成纤维细胞共培养[29]，结果显示促炎的IL-6、核因子κB 和TNF-α 表达下调；外泌体处理可保护关节软骨细胞免受过氧化氢诱导的凋亡。此外，外泌体处理促进骨膜细胞的软骨生成，增加软骨生成标志物，包括Ⅱ型胶原和β-catenin并表达较高水平的miR-145 和miR-221。这说明患者来源的ADSCs 产生的外泌体，可作为潜在的用于软骨再生和治疗骨关节炎的工具。

6 递送药物的载体

为了在恰当的时机将适量的药物递送到正确的位置，目前研究者正积极探索在空间、时间及剂量上调控药物生物体内分布的技术体系，即药物递送系统，以增加药物的利用效率、提高疗效、降低成本、减少毒副作用。近年来，多种纳米尺度载药体被用于临床，但因为材料和载体的安全性、免疫原性及网状内皮系统或单核吞噬细胞系统的快速清除作用，导致应用上的局限。

外泌体是一种有前途的治疗方法[30]，其具有天然、体积小、稳定性好、生物活性高、体内生物相容性好、靶向性强、毒性或免疫原性低、长期可维护性、免疫排斥反应低的优点。外泌体作为细胞间通信的主要参与者，不同的材料（例如蛋白质、miRNA、mRNA 等）可有效地包装在外泌体中并转移到其他细胞中。

例如，为了克服糖皮质激素全身给药后分布不明确、长期给药时出现严重不良反应的问题，有研究者设计了以叶酸-聚乙二醇-胆固醇复合物修饰表面的仿生外泌体包埋地塞米松磷酸钠的纳米颗粒FPCExo/Dex[31]，并建立主动靶向给药系统。体外实验显示：该系统通过抑制促炎性细胞因子和增加抗炎细胞因子，增强了对RAW264.7 细胞的内吞作用和抗炎作用。FPC-Exo/Dex 能有效地在炎症部位聚集，体内生物分布实验表明：FPC-Exo/Dex 能较好地保护CIA 小鼠的骨和软骨，并能显著减轻关节炎。体内安全性评价表明，这种仿生给药系统没有明显的肝毒性，具有良好的生物相容性。

单核细胞来源的髓样细胞在炎症相关的自身免疫/炎症性疾病和癌症中起着重要作用。有研究报道[32]：外泌体可以在体内向激活的髓样细胞传递诸如姜黄素之类的抗炎药。这项技术为诸如姜黄素等药物提供了一种手段，既可以针对炎症细胞，也可以避免不必要的非靶向效应。且利用外泌体作为传递载体，可以在血液中提供更稳定、更高浓度的姜黄素。

用编码FasL 的重组腺病毒体外转染DC 可促进外泌体的产生，该外泌体具有抑制DTH 模型中炎症进展并减轻CIA 动物模型的症状。以类似的方式，从表达IL-4 的DC 中分离出的外泌体能够抑制DTH 小鼠模型中已建立的CIA 症状并减轻炎症的严重程度。此外，与亲代DC 比较，DC 的外泌体产生了相似或改善的治疗结果。这些结果表明，外泌体是用于递送治疗炎性疾病的生物试剂的有效纳米载体[33]。

另外在递送miRNA 方面，研究显示：B 细胞衍生的外泌体是递送miRNA-155 抑制剂的理想候选药物[34]；人MSC 产生的高表达miRNA-124a 的外泌体，能够抑制细胞增殖、迁移并促进成纤维样滑膜细胞株的凋亡[35]。这都说明外泌体是递送治疗性miRNA 的理想载体，有望为治疗RA 提供新的方法。

7 小结

外泌体在RA 中的“一正一反”的两种不同作用逐渐被人们认识和重视，作为细胞间的“通信兵”，它也在RA 的诊断和治疗中显示出广阔的前景。外泌体蛋白和核酸等活性物质可以作为疾病诊断的标志物，为将来的体外诊断奠定了基础，但是究竟哪些是最佳的标志物、如何优选高效的外泌体分离方法并降低其经济成本是未来需要攻克的难题。

外泌体作为可以运输靶向药物的天然载体，具有稳定性好、生物活性成分高、靶向性强、毒性或免疫原性较低等优点，在RA 治疗领域大展拳脚并逐渐走向临床。来自人脂肪MSC 的外泌体已表现出对T 细胞分化和激活的抑制作用，人母乳中的外泌体可以在体外诱导Treg 细胞并抑制效应T 细胞活化从而治疗RA，这让人们看到了人工合成品甚至是天然获得的外泌体在治疗RA 方面的美好前景。