凋亡抑制蛋白介导泛素化在恶性黑素瘤发生发展过程中的作用

蔡桂月，邹锐涛，陈嵘祎 （1.广东医科大学，广东湛江 523023；2.南方医科大学皮肤病医院，广东广州 510091）

泛素是一个由76 个氨基酸残基组成的多肽，具有高度保守性，可对蛋白质进行翻译后修饰，泛素修饰的蛋白质可被蛋白酶体识别并降解，从而改变其定位、影响其活性、促进或干扰蛋白质之间的相互作用[1]。凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis proteins，IAPs)是一类存在于多种组织与细胞中具有抗凋亡活性的蛋白，与多种肿瘤的发生发展、化学耐药和预后等密切相关。在恶性黑素瘤（MM）中，多种凋亡抑制蛋白家族表达上调，具有RING 结构域的IAPs具有泛素连接酶（E3）活性，通过泛素化过程调节多种在MM发展中起重要作用的蛋白和信号通路参与MM 的发生、发展。本文对IAPs 通过泛素蛋白酶体系统在MM发生发展过程的作用机制作一综述。

1 泛素化过程在MM发生发展过程中的作用

泛素化是一个调控蛋白质表达的多步骤可逆反应，作为一种蛋白质翻译后修饰，它在细胞周期、细胞凋亡与DNA 损伤修复等多个胞内反应中发挥作用。异常的泛素化会使胞内生理过程的正常调节发生变化，从而广泛参与肿瘤的发生发展过程[2]。

泛素化修饰需要泛素活化酶（E1）、泛素结合酶（E2）、泛素连接酶（E3）依次发挥作用。E3 的作用是在泛素化过程中识别底物进行泛素化，决定了泛素化特异性，在包括MM 的多种肿瘤中均检测到E3 的突变或者表达差异。有研究发现神经前体细胞表达发育下调蛋白4-1(Nedd4-1)基因在MM 中高表达，将其敲除后，细胞内表达同源性磷酸酶-张力蛋白，磷酸化AKT 表达水平下调，导致细胞凋亡增加，表明Nedd4-1 在MM 中可能起癌基因作用[3]。同样，研究者还发现Nedd4L 基因和Smad 泛素化调节因子2 的表达也可能促进MM 细胞的增殖[4-5]。鼠双微粒体2(MDM2)作为调节抑癌基因p53 的泛素连接酶，通过泛素化过程降解移入细胞质的p53。在原发MM 中，MDM2 表达水平与肿瘤体积及侵袭性呈正相关[6]，且同时抑制MDM2和丝裂原活化蛋白激酶/细胞外调节蛋白激酶表达，可以抑制MM 细胞增殖[7]。MDMX 作为MDM2的同源类似物，同样具有泛素化降解p53的作用,可作为MM 联合治疗的有潜力的靶点之一[8]。最近有文献报道称E3 酶RING 也可以靶向p53 使其降解[1]。p27 为另一个重要的抑癌基因，SKP2 的上调通过泛素化降解p27、p57、p21 等抑癌基因，促进细胞生长。研究发现，从黑素细胞到色素痣再逐步发展成为转移性MM 的过程中，SKP2表达水平逐渐增加，而p27 水平逐渐降低，沉默SKP2 后，MM 细胞的增殖受到抑制[9-10]。泛素化是一个多种酶共同完成的过程，目前关于E3在MM 发生发展过程中的作用研究快速发展，但尚未有成熟的靶向药物报道。在MM 发生发展过程中，其他异常表达的抑癌基因和癌基因翻译的蛋白质是否也受泛素化过程调控，需要进一步研究。

2 IAPs的结构与功能

2.1 IAPs的结构特征

IAPs 是一类在细胞内表达结构具有同源性的蛋白分子，目前已发现的人IAPs 家族蛋白包括XIAP、cIAP-1、cIAP-2、ML-IAP、Survivin、NAIP、ILP-2 和BRUCE。IAPs 结构特征表现为三个结构域：N 末端杆状病毒IAP 重复子(baculoviral inhibitor of apoptosis repeats，BIR)、C 末端环锌指结构（ring zine-finger，RING)和Caspase 募集结构域(caspase recruitment domain，CARD)。所有IAPs 家族成员均含有BIR 结构域，BIR 通过与活化Caspase的N 端IBM 结合，在抑制细胞凋亡中发挥关键作用。某些IAPs 分子（如c-IAP1、c-IAP2、XIAP、ML-IAP 和ILP-2）C 端包含一个指环结构RING，RING 具有E3 活性，含有RING 结构域的IAPs 分子可以通过泛素蛋白酶体系统使自身或靶蛋白泛素化降解[11]。cIAP-1/2 含有CARD 结构域，此结构位于BIR 与RING 之间，由6 个α 螺旋构成，通过与其他包含此结构的蛋白分子形成寡聚体,调节细胞凋亡。

2.2 IAPs的抗凋亡机制

IAPs 分子主要通过与Caspase 结合，抑制其催化活性阻止细胞凋亡[12]，但各IAPs 家族成员分别介导不同信号通路发挥其抗凋亡功能。研究发现XIAP为最强的Caspase抑制剂，可直接抑制Caspase-3/7/9，阻止细胞凋亡，ML-IAP 分子N 端的BIR 和cIAP-1/2 的BIR2结构域参与调节活化的Caspase-3/7,cIAP-1/2的BIR3 与活化的Caspase-8 结合,阻止Caspase与底物结合,抑制其催化活性[13]。IAPs 亦可通过非Caspase 蛋白依赖途径抵抗凋亡，如XIAP、NAIP和ML-IAP可激活TAK1/JNK1 信号通路以抵抗肿瘤坏死因子α(TNF-α)诱导的细胞凋亡，XIAP 还可通过活化TNF-α受体进而激活核因子κB (nuclear factor kappa-lightchain-enhancer of activated B cells，NF-κB) 调控抗凋亡基因表达[14]，cIAP-1/2 可与TNF-α 受体相关因子2(TNFa receptor associated factor 2,TRAF2)结合，并且作为E3酶靶向受体相互作用蛋白1(receptor-interacting protein,RIP1)通过TAK1(TGF-beta activated kinase 1)信号途径激活NF-kB 进而抑制细胞凋亡[15]。

2.3 IAPs在MM组织中的功能

IAPs 最初被认为只对细胞凋亡有抑制作用，但随着研究的深入，人们发现多种具有RING 结构域的IAPs（包括XIAP、cIAP-1、cIAP-2、ML-IAP和ILP-2)具有E3活性，并且在细胞迁移、炎症反应和免疫应答等多方面发挥作用。

有研究者采用cDNA 微阵列研究显示，在MM 组织中有多种IAPs 家族成员的表达较黑素细胞痣高，包括ML-IAP、cIAP-l、cIAP-2、XIAP 等[16]。后续实验中，该研究者又采用HIC、CISH 和RT-qPCR 检测MM和黑素细胞痣组织中的ML-IAP,发现ML-IAP 在恶性黑色素瘤中的阳性率(47.6%～70.6%)明显高于其在黑素细胞痣中的阳性率(21.4%～25.0%)，提示ML-IAP可能在MM 发生发展中起重要作用，但在原发和转移性MM 之间，ML-IAP 阳性率无明显差异，提示MLIAP 在MM 的转移中作用较小[17]。Mousavi-Shafaei等[18]用寡核苷酸M706 下调ML-IAP 蛋白在MM 细胞中的表达，发现肿瘤细胞对化疗敏感性增高。Ayachi等[19]证实XIAP在转移性黑素瘤和侵袭性黑素瘤细胞系中表达增高，敲除XIAP基因后，MM 细胞的迁移和纤维连接蛋白层表面细胞边缘的局灶性粘连的形成显著减少。此外，有研究显示，IAPs家族成员survivin水平在MM 组织中表达增高,抑制survivin 的表达可以使肿瘤细胞凋亡增加[20]。Zhou 等[21-22]分别研究了ML-IAP 和XIAP 作为免疫原性靶点在MM 中的潜在作用，发现MM 患者对两者均有较高频率的免疫应答，且细胞和体液免疫反应与良好的免疫治疗效果相关。有趣的是，有研究者发现XIAP、cIAP-1/2 和MLIAP 通过泛素化降解CARF 蛋白激酶促进细胞凋亡，抑制MM 细胞的迁移和侵袭[23]。两种截然相反的研究结果说明IAPs 可能在MM 发展的不同阶段调控不同的分子和信号通路或其自身也被不同分子调控，从而导致这种抑制凋亡或促进凋亡效应的差异性，进一步揭示IAPs 在MM 发生发展中起着举足轻重的作用。Rac1属RhoGTP 酶家族，与MM的增殖、侵袭、恶性进展有关，与良性痣皮损比较MM 病灶存在Rac1高表达，且恶性程度高的MM 细胞系Rac1 活性也明显增高[24]。Oberoi-Khanuja 等[25]发现IAPs 可以发挥E3 酶活性靶向Rac1，使其通过泛素化过程被蛋白酶体降解。IAPs 依赖自身的E3 活性参与MM 细胞凋亡、细胞迁移、炎症反应和免疫应答等生理过程，但其具体的信号通路和分子机制尚未明了，进一步阐明IAPs 如何调控MM 细胞的增殖、迁移和侵袭，从而影响MM 的发生发展，对MM 患者的治疗及预后至关重要。

3 以IAPs为靶点治疗MM

目前，MM 的治疗包括手术治疗、放疗和化疗等传统方式以及近十年研究热点免疫治疗和靶向治疗，虽然治疗方式多样，但MM 患者生存率仍未得到明显改善，因此，寻找安全有效的治疗靶点成为重要课题。

IAPs 对MM 进展的作用研究结果表明，它们可能是治疗干预MM 的有价值的靶点。目前研究人员已开发出多种单价和二价IAPs 拮抗剂，它们能诱导细胞凋亡和/或使癌细胞对其他凋亡诱导疗法敏感。这些抑制剂中大多数可以同时抑制多个IAPs 家族成员，称为泛抑制剂，与之对应的特异性抑制单个IAPs的称为选择性抑制剂[26-27]。研究表明选择性抑制剂对于诱导细胞凋亡的作用有限，提示各个IAPs 家族成员之间可能具有协同作用[28]。单独抑制survivin 或ML-IAP 在临床实验中均未取得良好疗效，但利用ML-IAP 具有高度免疫原性的特点，用免疫疗法靶向ML-IAP阳性的肿瘤可以改善疗效[29]。有研究小组发现使用单链反义寡核苷酸靶向XIAP，使之选择性被拮抗后可能具有一定抗肿瘤活性，然而同时抑制XIAP 和cIAP 可以获得更好的疗效[30-31]。单独抑制IAPs 可能是其他凋亡诱导方式的促进剂，Engesæter等[32]用siRANA将XIAP敲低后，MM细胞对凋亡诱导剂TRAIL 诱导凋亡的敏感性增强；Yuan 等[33]发现肿瘤靶向传递TNFα和IAPs抑制剂LCL161联合运用可显著抑制黑素瘤异种移植小鼠的肿瘤生长和存活，并且比单独使用两者中任何一种药物都更有效。有趣的是，在对具有BRAF 蛋白激酶突变的MM 患者研究中发现，IAPs抑制剂birinapant和TNFα联合治疗在对BRAF 抑制剂具有获得性耐药性的黑素瘤细胞中有效，表明IAP 抑制剂对具有耐药性的患者可能有益[34]。愈来愈多IAPs 抑制剂进入了临床研究阶段，但对于黑素瘤有明显疗效且具有安全性的药物待进一步研究。我们已经阐述了IAPs 可能在黑素瘤不同阶段发挥不同作用，希望能在不久的将来，科研工作者可以揭示出IAPs 隐藏的奥秘，为黑素瘤患者们带去福音。

4 小结

大量证据表明IAPs 家族成员通过泛素化蛋白酶体系统调控相关蛋白和信号通路，在黑素瘤的发病机制中具有重要作用。通过研究黑素瘤中异常的IAPs表达及泛素化过程，有助于寻找遏制MM 不断恶化的治疗靶点。此外，不管是削弱抑癌基因表达的蛋白质泛素化降解或是加强原癌基因表达的蛋白质泛素化降解都是肿瘤治疗中有潜力的研究方向，值得科研工作者进行深入探讨。