多重RT-PCR与毛细电泳联用技术在儿童下呼吸道感染病原体检测中的应用*

冯星星，李 明，贺晓丽

云南省昆明市儿童医院/云南省儿童重大疾病研究重点实验室：1.检验科；2.呼吸内科；3.云南省儿科研究所，云南昆明 650028

急性下呼吸道感染(ALRTI)是临床儿童最为常见的感染性疾病，病原学复杂，对儿童健康造成严重威胁，其中病毒是婴幼儿和学龄前儿童最为主要的ALRTI病原[1]。在儿童ALRTI中明确感染的病原体，对于疾病早期诊断和特异性抗病毒治疗，选择合理治疗方案非常重要。目前，国内实验室开展检测较多的是采用直接免疫荧光法(DFA)检测7种常见的呼吸道病毒抗原：呼吸道合胞病毒(RSV)、腺病毒(ADV)、甲型流感病毒(InfA)、乙型流感病毒(InfB)、副流感病毒1、2、3(PIVⅠ、PIVⅡ、PIVⅢ)，但是在ALRTI中常见的鼻病毒(HRV)、冠状病毒(HCOV)和近年来新发现的偏肺病毒(HMPV)、博卡病毒(HBOV)等也被证实是引起儿童呼吸道感染的重要病原，这几种病毒均不能采用DFA进行常规检测。为了满足临床诊治的需要，近年来核酸检测技术的应用成为呼吸道病原体外诊断的新方向，采用多重RT-PCR技术可同时检测RSV、HRV等在内的13种呼吸道病原体，因此，本研究应用多重RT-PCR技术和DFA同时对38例儿童ALRTI痰液标本进行呼吸道病原体检测，比较两种方法的检测结果，探讨多重RT-PCR技术在儿童ALRTI检测中的临床价值。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2019年12月至2020年1月昆明市儿童医院因呼吸道感染收治入院患儿38例。其中男22例，女16例，年龄12 d至7岁。收集其痰液标本38份。

1.2仪器与试剂 3500Dx基因分析仪和PCR基因扩增仪是购自美国ABI公司；Olympus-BX65荧光显微镜购自Olympus公司；13种病原体多重检测试剂盒是购自宁波海尔施科技有限公司，各病毒扩增核酸片段大小信息见表1；核酸提存或纯化试剂，备案号：浙甬械备2015 0006号；7项呼吸道病毒检测试剂盒(免疫荧光法)购自美国Diagnostic Hybrids公司。

1.3方法

1.3.1标本采集 患儿入院后由专业护士用一次性吸痰管抽吸痰液1.0～2.0 mL置于无菌培养管中，不得倾斜或颠覆，标本采集后2 h内送检，将标本分成2份，分别进行多重RT-PCR实验和DFA实验。

1.3.2多重RT-PCR

1.3.2.1样本前处理 在痰液中加入等体积生理盐水，彻底混匀，吸取上清液进行核酸提取。

1.3.2.2核酸提取 使用核酸提取或纯化试剂(备案号：浙甬械备2015 0006号)进行手动核酸提取，向每份参与提取的标本(包括ResP阳性对照和阴性对照)中加入2 μL的RT-PCR内参共同提取。13种呼吸道病原体多重检测试剂盒所检测的病原体对应扩增片段如下：InfA，105.2 nt;ADV，112.7/114.7 nt;Boca，121.1 nt;HRV，129.5 nt;人RNA内参(huRNA)，147.0 nt;甲型流感病毒H1N1(2009)(09H1)，158.6 nt;PIV，179.1 nt;衣原体(Ch)，188.2 nt;HMPV，199.9 nt;InfB，207.0 nt;肺炎支原体(Mp)，212.3 nt;人DNA内参(huDNA)，232.5 nt;甲型流感病毒H3N2(H3N2)，241.0 nt;HCOV，261.7 nt;RSV，276.7 nt;RT-PCR内参(IC)，313.0 nt。

1.3.2.3配制RT-PCR体系 (1)对ResP预混液进行彻底涡旋，瞬时离心10 s；将RT-PCR酶混合液瞬时离心10 s后竖直置于冰上。(2)计算样品数目N(N=阳性对照1个+阴性对照1个+临床待检样品数目)，在1.5 mL离心管中依次加入以下体积试剂：14 μL ×(N+1)的ResP预混液和1 μL ×(N+1)的RT-PCR酶液。将离心管中的混合液颠倒混匀并瞬时离心后，竖直置于冰上。(3)取15 μL的混合液分装至各个PCR管中，瞬时离心10 s，将PCR管竖直置于冰上，由于混合液较黏稠，为确保分装准确，建议采用反向移液法(吸液时先将移液器按压至第2档，之后放松移液器以吸取混合液，推液时压至第1档结束)。

1.3.2.4RT-PCR扩增 在上述PCR管中按顺序分别加入阳性对照、阴性对照和待检测的核酸样品各5 μL，完成加样后，将PCR管瞬时离心10 s，并置于冰上。为避免污染，建议先加入阴性对照，再加入待检测核酸，最后加入阳性对照。PCR扩增条件：25 ℃ 5 min，50 ℃ 15 min，95 ℃，2 min；94 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，共6个循环；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，共29个循环；72 ℃ 10 min；4 ℃保存。

1.3.2.5毛细电泳仪荧光信号强度的测量 (1)配置毛细电泳液：使用标准品测量毛细电泳平台中所有毛细管的荧光信号强度，配置标准品电泳液，Hi-DiTMFormamide 9 μL × 8孔SIZE-500 Plus 0.25 μL × 8孔，标准品1 μL × 8孔。(2)加样：将配制好的标准品电泳液涡旋混匀后，分别取10 μL加入到每道毛细管对应的96孔板上进行电泳分离，得到每道毛细管中标准品的峰高度。(3)PCR产物的毛细电泳分离：制备电泳样品，Hi-DiTMFormamide 9 μL/孔，SIZE-500 Plus 0.25 μL/孔，PCR产物1 μL/孔。3500Dx遗传分析仪毛细电泳分离样品，选择“Fragment”电泳分离方法(参照3500Dx基因分析仪使用说明书)。

1.3.2.6样品检测结果判断 检测样品的峰型图中同时出现人RNA内参、人DNA内参，且峰高度高于该道毛细管中标准品高峰，说明样品取样成功，未发生明显降解且核酸提取成功；若出现内置RT-PCR内参的特征峰，且峰高度高于该道毛细管中标准品高峰，其监控整个操作流程，说明实验流程正常。由于竞争扩增原因，该峰可能降低甚至消失。(1)以ResP阳性对照为模板的峰型图中必须出现16个特征峰，且16个特征峰的峰高度均高于该道毛细管中标准品高峰。以阴性对照为模板的峰型图中必须出现人DNA内参和RT-PCR内参的特征峰(也有可能出现人RNA内参的特征峰)，且这2个特征峰的峰高度均高于该道毛细管中标准品高峰。(2)扩增产物中的目标位点峰高度低于该道毛细管标准品峰低峰(NegS)的，判该位点阴性。(3)扩增产物中的目标位点峰高度高于该道毛细管标准品峰高峰(PosS)的，判该位点阳性。(4)扩增产物中的目标位点高于该道毛细管标准品低峰，但低于标准品高峰的，判断该点灰区；峰高度落在灰区的样品建议重新提核酸进行检测，若样品仍在灰区或落在阳性区域的，判阳性。若重复检测落在阴性区域的，判阴性。

1.3.3DFA 痰液标本中加入磷酸盐缓冲液(PBS)5～10 mL,在涡旋混匀器上轻微混匀，以1 500 r/min离心5 min，去除上清留取沉淀，再用PBS洗涤沉淀1～2 次，洗涤要彻底，避免残留黏液产生非特异性荧光。最后，将沉淀液溶解在0.5～1.0 mL PBS中，吸管轻轻吹打使其成为细胞悬液，移液器吸取25 μL细胞悬液于玻片上点样共7点，分别用于检测RSV、ADV、InfA、InfB、PIVⅠ、PIVⅡ、PIVⅢ。玻片空气中室温干燥后，冷丙酮固定10 min。玻片上每个细胞点加1滴相应的荧光抗体，必须完全覆盖待测标本，将载玻片放在湿盒中置于37 ℃培养箱孵育30 min，然后用事先配置好的PBS浸泡洗涤。干后用封闭液封片，盖上盖玻片，于荧光显微镜下观察，以200倍视野见到≥2个苹果绿荧光细胞为阳性，否则为阴性。试剂盒提供的阳性对照按同样方法处理。

1.4统计学处理 应用SPSS22.0统计软件进行数据分析，计数资料以率表示，组间比较采用配对四格表McNemar检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1多重RT-PCR病原体检测结果 38例住院下呼吸道感染患儿的痰液标本中，多重RT-PCR检出至少一种病原体阳性36份，检出率94.7%(36/38)，其中InfB阳性最多，为20例(52.6%)，其次检出RSV阳性14例(36.8%)，09H1阳性8例(21.0%)，HRV阳性6例(15.8%)，PIV阳性4例(10.5%)。其中检出2种或2种以上呼吸道病原体混合感染14份，检出率为36.8%(14/38)，分别检出2种呼吸道病毒混合感染12份，3种病毒混合感染2份，混合感染中最常见的病毒为InfB，占31.6%(12/38)。另有8种病原体未检出阳性样本。

2.2多重RT-PCR和DFA检测结果比较 选取与DFA检测相同的RSV、ADV、InfA、InfB、PIVⅠ、PIVⅡ、PIVⅢ 7种病毒进行比较，RT-PCR检出阳性36份，检出率94.7%(36/38)，DFA检出阳性16份，检出率42.1%(16/38)，多重RT-PCR阳性率高于DFA法阳性率，差异有统计学意义(P<0.01)。

3 讨 论

急性下呼吸道感染是全球婴幼儿感染性疾病发病和死亡的一个重要原因，大多数感染由呼吸道病毒引起，由于这些病毒感染的临床表现和流行特点相似，因此难以用临床症状和常规检测方法进行病原鉴定区分[2]。多重RT-PCR与毛细电泳联用技术一次性检测13种呼吸道病原体，该平台特异度强，灵敏度高，与荧光定量PCR检测结果的一致率达97.5%[3]。本研究中检出InfB最多，阳性率为52.6%(20/38)。InfB是引起流行性感冒发生和流行的主要病原体之一，近年来儿童在流感高发季节感染率呈上升趋势[4]，所以要警惕在冬春季由于InfB引起的流感暴发流行对儿童身体健康带来的危害。本研究检出RSV阳性14例(36.8%)、HRV阳性6例(15.8%)，RSV感染是诱发或加重婴幼儿哮喘的重要危险因素，HRV是引起ALRTI患儿喘息的重要病毒病原可诱发儿童哮喘急性发作[5]，儿童感染HSV与RSV引起的临床表现相类似，故应重视区分由HSV和(或)HRV感染引起的ALRTI。本研究中检出8例(21.0%)InfA全部为09H1亚型，通过本研究可鉴别InfA的09H1和H3N2两个亚型，为儿童流感预防接种和流行病学调查提供依据。本研究检出2种或2种以上呼吸道病毒混合感染14例，检出率为 36.8%(14/38)，目前普遍认为混合感染的流行病学特点和临床特征与单一感染有所不同[6]，多重RT-PCR具有更广病原谱，有助于发现ALRTI患儿病原体混合感染情况。本次研究受制于样本量关系有8种病原体未能检出，随后将进一步研究。

DFA是目前实验室检测呼吸道病毒抗原的常规方法，它用荧光标记单克隆抗体对7种呼吸道病毒抗原直接进行检测，是一种特异性及敏感性较高的诊断呼吸道病毒感染的方法[7]。本研究中，多重RT-PCR病毒阳性检出率显著高于DFA(P<0.01)，与相关文献报道相符[8]。原因可能为RT-PCR法灵敏度高于DFA，同时DFA技术手工操作易受到标本采集的影响，导致检测细胞数量不够，影响阳性检出率，在结果判断上依赖技术人员的主观判断，也会影响结果判断。

综上所述，多重RT-PCR与毛细电泳联用技术是一种快速和准确的高通量分析的新型技术，可同时检测常见的13种病原体，实验在一个扩增管中进行一步法RT-PCR扩增，采用毛细管分离不同长度扩增产物得到病原体检测结果，通过对样品中人RNA和人DNA同时检测进行质量控制，整个实验具有封闭体系，可有效防止产生气溶胶，可以检测多重感染，能为规范儿童ALRTI实验室快速诊断和临床治疗提供有力保证。