治疗前血浆和全血干血斑样品HIV-1 Pol区基因型耐药检测结果比较*

蔡晓莉，范庆红，兰 芸，李丽雅，王瑾琳，陈伟烈

广州医科大学附属广州市第八人民医院传染病研究所，广东广州 510000

获得性免疫缺陷综合征(AIDS)是因人类免疫缺陷病毒(HIV)感染导致的机体免疫系统遭到破坏，造成许多伺机性疾病的攻击，促成多种临床症状的一种综合症状[1]。据统计，全球总计有3 690万AIDS存活者，然而在2017年全球仍有94万人死于AIDS相关疾病，新发感染病例仍达180万左右；我国AIDS疫情形势严峻，感染人数呈缓慢上升趋势，截至2018年底存活感染者约125万，全人群感染率约为9/10 000[2-3]。高效抗逆转录病毒治疗(HAART)，即鸡尾酒疗法，是目前治疗和缓解HIV感染最有效的方式[4]。我国从2003年开始推广免费的抗病毒治疗方案，使AIDS患者的病死率显著下降，生活质量显著提升。随着抗逆转录病毒治疗(ART)的推广，药物压力逐渐升高，一方面由于长期服药的不良反应，患者依从性下降，最重要的是，HIV自身的高度变异性导致HIV耐药问题日趋严重，治疗效果不佳。因此，建立耐药基因的人群筛查工作刻不容缓。目前关于HIV的耐药检测，主要是针对HIV-1建立的基因型耐药检测和表型耐药检测两种方式，在国内主要应用基因型分析方法来进行耐药性监测。

基因型耐药检测的样品主要来自HIV-1感染者的血浆或全血，但是对于一些实验室条件较差的地区医院，全血或血浆样品在采集、分离、保存和运输过程中不可避免地会遇到一些难题，HIV感染者全血或血浆样品属于危险生物制品，需专人看护、冷链运输。全血干血斑(DBS)样品在一定程度上可以解决血浆或全血样品在采集、保存和运输上存在的问题，为贫困地区监测HIV-1耐药性提供便利[5]。但是，由于DBS样品承载的样品量有限，其检测灵敏度较血浆或全血样品低。本研究采集了治疗前44例来自本院的HIV-1感染者的全血，分别制备血浆、全血DBS样品，通过逆转录PCR(RT-PCR)分别扩增血浆和全血DBS样品HIV-1 RNA并进行基因型耐药分析，将血浆和DBS检出结果进行对比，比较二者在检出率、HIV-1病毒载量、亚型、耐药突变位点及耐药检测结果等方面的差异，以验证全血DBS样品用于HIV-1亚型分析和耐药性检测的可行性，为其在临床检验中的应用提供依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集本院收治的44例HIV-1感染者的临床资料。此前均未接受HAART治疗。其中男40例，女4例；年龄19～79岁，中位年龄32岁；基线CD4细胞中位数289个/μL、CD8细胞中位数923个/μL、CD4/CD8比例中位数0.29。

1.2方法

1.2.1样品制备 静脉采集44例HIV-1感染者乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K2)抗凝血10 mL，依照文献[5]中的方法制作全血DBS样品，每例患者样品制作3～5个血斑，室温干燥保存。将剩余的EDTA-K2抗凝血以3 500 r/min离心5 min，收集血浆，制备血浆样品，-20 ℃短期保存或-80 ℃长期保存。

1.2.2HIV-1 RNA提取 血浆样品RNA提取：取200 μL的血浆用核酸提取纯化试剂盒(中山大学达安基因股份有限公司)于Smart 32核酸提取仪(中山大学达安基因股份有限公司)进行提取，所得RNA保存于-80 ℃。DBS样品RNA提取：剪取DBS滤纸片，按照海力特核酸提取试剂盒(广州海力特生物科技有限公司)的操作说明进行RNA提取，将所得的RNA样品保存于-80 ℃。

1.2.3HIV-1 病毒载量测定 分别吸取提取的血浆或DBS样品的RNA 20 μL，按照HIV-1核酸测定试剂盒(PCR荧光探针法，中山大学达安基因股份有限公司)操作说明加样，于ABI Viia7高产率荧光定量PCR仪(Lifetech，美国)上机测定，根据标准曲线计算各样品病毒载量。

1.2.4RT-PCR反应 采用巢式PCR反应扩增HIV-1 Pol区基因序列(HXB2,2253～3318 nt)，使用PrimescriptTMone step RT-PCR Ver.2.0试剂盒(TAKARA,日本)对提取的病毒RNA进行逆转录和PCR扩增[6-7]。第1轮扩增使用外引物：MAW引物序列为5′-TGGAAATGTGGAAAGGAAGGAC-3′，RT-21引物序列为5′-CTGTATTTCTGCTATTAAGTCTTTTGATGGG-3′。反应程序：25 μL体系，50 ℃ 30 min，94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，35个循环，72 ℃ 5 min。第2轮PCR扩增使用内引物：PRO-1引物序列为5′-CAGAGCCAACAGCCCCACCA-3′，RT-20引物序列为5′-CTGCCAGTTCTAGCTCTGCTTC-3′。反应程序：50 μL体系，95 ℃ 3 min，95 ℃ 30 s，63 ℃ 30 s，72 ℃ 80 s，31个循环，72 ℃ 5 min。

1.2.5Sanger 测序 将已扩增的PCR产物用QIAquick 胶回收试剂盒(QIAGEN,德国)纯化后进行Sanger测序，委托天一辉远基因科技有限公司进行测序。

1.2.6系统进化树分析及亚型鉴定 Sanger测序得到的Pol区前1 300个碱基序列，用Sequencher 5.4.5软件双人对序列进行清理和拼接，混合碱基按照30%比例主峰的次级峰进行判定。采用BioEdit 7.2软件对拼接好的序列进行比对[8]。采用MAGE 6.06软件建立邻接法进化树，参考株选择HIV-1病毒M组亚型株A(A1、A2)、B、C、D、F(F1、F2)、G、H、J、K、CRF01-AE、CRF07-BC、CRF08-BC、CRF55-01B、CRF59-01B、CRF67-01B等，下载自HIV Database数据库(www.hiv.lanl.gov/content/index)。

1.2.7HIV-1基因型耐药分析 将Fasta序列文件，输入HIV Database数据库BLAST对亚型进行比对，将序列提交Stanford HIV耐药数据库(https://hivdb.stanford.edu/hivdb/by-sequences/)分析蛋白酶抑制剂(PI)、核苷类逆转录酶抑制剂(NRTI)以及非核苷类逆转录酶抑制剂(NNRTI)基因型耐药突变[9]。

2 结 果

2.1血浆和DBS样品PCR扩增检出率 44例HIV-1感染患者治疗前血浆样品提取RNA后PCR扩增，1%琼脂糖凝胶电泳出现目的条带有44个，阳性检出率为100.0%(44/44)；在DBS样品中，1%琼脂糖凝胶电泳出现目的条带的有30个，无条带样品为14个，DBS样品阳性检出率为68.2%(30/44)。

2.2血浆和DBS样品病毒载量 24例治疗前HIV-1感染患者血浆样品和DBS样品荧光定量PCR探针法检测HIV-1病毒载量。结果显示，血浆样品中病毒载量均达到1.0×103IU/mL以上，平均病毒载量为5.02×105IU/mL，中位数为1.76×105IU/mL；DBS样品中平均病毒载量为1.46×103IU/mL，中位数为7.95×102IU/mL，DBS样品病毒载量远低于血浆样品。

2.3系统进化分析 44例血浆样品和30例DBS样品Pol区基因序列与参考株在BioEdit 7.2软件比对后，MEGA 6.06软件建立邻接法进化树。通过邻接法进化树分析发现，这44例患者所感染HIV-1为CRF07-BC(24/44)、CRF01-AE(16/44)、CRF59-01B(2/44)、B(1/44)、CRF67-01B(1/44)，其中CRF07-BC和CRF01-AE为主要亚型病毒株。同时，对血浆和DBS基因序列比较发现，30例扩增检出成功的DBS Pol区基因序列与血浆样品Pol区序列相似值为100%的有26例(26/30)，相似值为99%的有3例(3/30)，相似值为97%的有1例(1/30)，提示血浆和DBS Pol区基因序列具有高度的一致性。

2.4血浆和DBS样品基因型耐药的差异 治疗前血浆样品中有6例出现基因型耐药，且6例患者对PI均未产生耐药突变位点。其中1例血浆样品在D67N(1/44)和K219Q(1/44)位点产生对NRTI耐药突变，D67N位点对阿巴卡韦(ABC)、去羟肌苷(DDI)、替诺福韦(TDF)存在潜在低水平耐药；K219Q位点对齐多夫定(AZT)、司他夫定(D4T)存在低水平耐药。在NNRTI中，V179D(3/44)、V179E(2/44)、G190A(1/44)发生突变，在V179E/D位点主要对依法韦仑(EFV)、依特韦林(ETR)、奈韦拉平(NVP)及利匹韦林(RPV)存在潜在低水平耐药；G190A对ETR有潜在低水平耐药性，对RPV低水平耐药性，对EFV有中等耐药性，而对NVP产生高度耐药性。在成功检出的30例DBS样品中，3例DBS样品出现了耐药突变，其中1例同样在D67N(1/44)和K219Q(1/44)位点出现NRTI耐药突变，这3例DBS样品分别在V179E(1/44)、V179D(1/44)G190A(1/44)位点出现NNRTI耐药突变，耐药分析的结果与血浆一致。与血浆样品的基因型耐药检测结果相比，DBS样品HIV-1亚型、耐药突变位点和耐药分析结果均一致，但是在PI和RTI的其他突变位点中，DBS样品在位点突变数量和突变形式均有一定的差异。

3 讨 论

随着ART在全球规模的推广，HIV-1感染的发病率和病死率显著降低。但是，HIV耐药性对ART的长期效果构成潜在威胁，并且正在成为联合国2016年报告的“到2030年消除HIV作为全球公共卫生安全问题”的巨大威胁，监测ART耐药有利于及时对患者用药做出调整[10-11]。目前，利用RT-PCR对HIV-1 Pol区基因型检测是对ART耐药监测的主要方法。常规耐药检测样品使用的一般是HIV患者的血浆，但是血浆在采集、运输及保存方面并不占优势，而DBS样品由于其良好的稳定性、易运输性以及采集方面的优势，成为血浆样品耐药检测潜在的良好替代品。本研究结果发现，DBS与血浆样品在亚型分析结果以及耐药结果上保持一致，虽然在个别其他突变位点上存在一定差异，但是并不影响耐药结果的准确性。有研究发现，DBS样品可用于HIV抗体和抗原检测、HIV核酸定性和定量检测、HIV基因型别与耐药性的筛查鉴定等，与配对血浆样品具有99%以上的一致性[12-13]。DBS样品相比于血浆在阳性检出率及病毒载量方面均有较大的劣势。

本研究中，DBS样品阳性检出率为68.2%，平均病毒载量为1.46×103IU/mL，分布在1.30×102～7.90×103IU/mL；而血浆样品检出率达到100.0%，平均病毒载量5.02×105IU/mL，分布在6.64×103～3.30×106IU/mL，DBS样品病毒载量要远低于血浆。由于在本研究中，只剪取了1个DBS滤纸片，这可能是DBS样品检出率低于血浆的主要原因。结合上述分析，后续增加DBS滤纸片的数量，提取RNA可能会大大提高DBS样品检出率。

亚型分析中，将所有比对完成的序列和参考株序列通过MAGE 6.06软件建立邻接法进化树，共鉴定出5种HIV-1病毒株：B型、CRF01-AE、CRF59-01B、CRF67-01B、CRF07-BC，且DBS与血浆样品基因序列高度一致。同样耐药分析结果显示，在44例血浆样品中6例出现耐药突变，在成功检出的DBS样品中有3例出现耐药突变。与血浆样品耐药分析结果相比，除了少数其他突变位点存在差异，DBS耐药结果与血浆高度一致，通过比对差异位点的碱基发现，主要是因为存在混合碱基导致其他位点的突变存在差异。这为DBS样品应用于HIV患者的耐药分析及亚型分析提供了实验依据。

目前，DBS样品检测已应用于耳聋基因检测[14]、梅毒酶联免疫吸附试验检测[15]、新生儿足跟血DBS筛查地中海贫血[16]以及孕妇中期DBS产前检测[17]等的报道，DBS在临床检测方面的应用逐步扩大。结合本研究的结果，虽然DBS样品在检出率上与血浆相比仍有所不足，但是DBS样品在采集和运输方面更加便利，DBS样品充分干燥后可按非感染性物质运送，不需要传统的血浆或全血样品冷链运输，这极大地节约了运输成本。对于我国偏远地区，由于技术和交通方面均较为落后，HIV耐药监测和流行病学调查不方便开展，DBS样品此时就具有巨大的优势。另一方面，DBS样品亚型分析结果与耐药分析结果的准确性也为DBS样品的推广应用奠定了基础。因此，优化后的DBS样品检测将是未来HIV耐药监测以及流行病学调查的一个创新模式。