甲胎蛋白异质体在肝脏疾病诊断及预后价值中的研究进展*

王 娟 综述，贺琤雯 审校

1．海军军医大学第一附属医院实验诊断科，上海 200433；2．南方医科大学医学检验专业2016级，广东广州 510515

原发性肝癌(PLC)是我国常见的恶性肿瘤之一，它是因肝内胆管细胞或肝细胞变异或受到致病菌侵袭导致的恶性肿瘤，具有较高的病死率。早期诊断与治疗是延长患者生存周期，提高治疗效果的关键。甲胎蛋白(AFP)异质体AFP-L3是《原发性肝癌诊疗规范(2011年版)》推荐的PLC诊断指标，它具有灵敏度高和特异度高等特点[1]。作为肝癌细胞特异性生成的AFP亚型，它与癌细胞增殖程度密切相关，并在肝脏疾病的早期诊断及预后评估中起重要作用[2-3]。鉴于AFP异质体在肝脏疾病中的重要作用，笔者对AFP异质体的检测方法及其与肝脏疾病诊断、预后的关系等方面进行了综述。

1 AFP异质体的分类

AFP是一种含有两条复合糖链的胚源性糖蛋白，60年代起就作为肝脏恶性肿瘤的标志物。由于来源的不同，其分子在糖链结构的亚结构上表现也不同，由此衍生出AFP变异体，也称AFP异质体。OKUYAMA等[4]根据AFP与外源性凝集素结合能力的差异，采用扁豆凝集素(LCA)亲和双向放射免疫电泳法，将人体血清AFP分成LCA结合型和LCA非结合型两种类型异质体。从阴极开始在LCA亲和电泳上AFP的条带依次是L1、L2、L3，分别命名为AFP-L1、AFP-L2、AFP-L3。其中AFP-L1主要存在于慢性肝炎和肝硬化患者血清中，构成非恶性肝病AFP的主要部分；AFP-L2主要来自卵黄囊肿瘤，怀孕期间母体内可检测到；AFP-L3是一种异常糖基化AFP，为肝癌细胞特异性产生[5-6]。前两者为LCA非结合型，后者为LCA结合型，目前人们通常所说的AFP异质体实际是指与LCA结合的AFP-L3[7]。

2 AFP异质体检测技术

2.1亲和免疫交叉电泳法 亲和免疫交叉电泳是检测AFP异质体的传统方法，具体是将LCA和琼脂糖均匀混合制成凝胶板，血清点样后进行电泳。根据其分子量大小，与LCA结合的糖蛋白电泳速度降低，以此与非结合型分离。然后再做垂直免疫电泳，AFP异质体与抗AFP抗体结合形成沉淀峰，经考马斯亮蓝法、放射自显影法或酶标法等显色技术显色后进行定量测定[8]。此方法操作相对简单，但干扰因素较多，显带图像不够清晰，灵敏度较低，故临床目前较少采用此方法进行AFP-L3的检测。

2.2亲和吸附法 亲和吸附法采用亲和吸附离心柱，柱内装有耦联了LCA的琼脂糖作为亲和介质[9]。以液相竞争为基础，在原有AFP测定的基础上增加一个亲和吸附的前处理步骤，当血清通过离心柱时，与LCA结合力强的留在柱中，经过清洗液除去未结合的AFP亚型，最后浸泡洗脱得到较纯的结合型AFP-L3。AFP-L3及总的AFP可用化学发光法定量检测。目前临床采用商品化的微量离心柱法试剂，可以快速、简便地获得标本中的AFP-L3成分，然后应用化学发光方法进行定量检测，方法简单，结果较为准确，成本较低，是目前临床常用方法。

2.3AFP-L3蛋白芯片 该方法将鼠源AFP单克隆抗体和小LCA点样固定在醛基玻片上，制备出AFP抗体和小LCA蛋白芯片，并对血清标本进行检测，最后利用化学发光方法获得各个待测标本的化学发光像素值。该蛋白芯片检测方法实现了在同一检测窗内，通过一次血清标本加样，同时检测AFP和AFP-L3。该方法兼有方便省时和经济实用两大优势，未来可应用于进行大规模的肝细胞癌(HCC)筛查检测，也为未来多种肿瘤标志物同时检测提供了可参考的新途径。

2.4全自动电泳荧光免疫分析法 随着自动化仪器的普及，全自动免疫分析仪在临床得到广泛应用。该方法通过使用免疫荧光法在液相中进行抗原抗体反应后，分离并检测形成的免疫复合物，通过计算各组分荧光强度的峰面积，得到AFP-L3的比值。试剂由测定对象物质中具有亲和性的抗原、抗体、受体等加上阴离子构成。测定程序大体分为5个步骤：(1)形成阴离子结合物(结合了DNA的标识体)、测定对象物质及荧光结合物(结合了荧光物质的标识体)的复合体的液相反应工序。(2)通过形成的复合体与复合体结合的阴离子的移动力，进行等速电泳、浓缩的工序。(3)感知电位差，从等速电泳切换到区带电泳的工序。(4)利用区带电泳的复合体分离工序。(5)利用激光引起荧光测定的分析工序。该方法快速高效，极大地提高了检测的敏感性和特异性。并能实现AFP+AFP-L3+维生素K缺乏或拮抗剂-Ⅱ诱导的蛋白质(PIVKA-Ⅱ)联合检测，提升了早期HCC的诊断效能，弥补单项检测的不足[10]。同时，由于操作简便，快速且重复性好，该方法被越来越多的临床实验室所接受。

3 AFP异质体的临床应用

3.1肝脏疾病鉴别诊断 过去认为AFP偏高一般意味着肝癌的发生，但许多良性肝脏疾病，如肝损伤、充血性肝大，也会使AFP升高，单凭AFP结果难以区分良、恶性病变。AFP-L3升高与肝癌细胞生成较多的AFP-L3分子有关，且AFP-L3占血清AFP的百分比(AFP-L3%)升高不依赖于总的AFP水平，体现了良恶性细胞的异质性，能够排除良性肝病引起的AFP升高[11-13]，具有更高的特异度。慢性乙型肝炎(CHB)患者血清中AFP-L3水平显著高于健康人群[14]，且随着Child-Pugh分级增加，血清AFP-L3水平呈上升趋势[15]，进一步说明AFP-L3可检测肝细胞损伤程度，作为评估肝功能的重要指标。AFP-L3不受影像学阴影束缚[16]，其阳性率与癌肿块大小无关，而AFP水平与之呈正相关，小肝癌(癌最大径<2 cm)患者中三分之一不会有AFP升高，但约35%患者血清中可检测到AFP-L3[17]。AFP-L3阳性的肝癌有快速生长和早期转移的潜在可能。

3.2PLC的疗效评估及预后判断 PLC患者血清中AFP-L3普遍高表达，并且与TNM分期和转移相关[14]。目前治疗肝癌的最有效方法依然是手术切除，早期切除对患者预后疗效有一定帮助。切除后AFP水平随之下降，下降速度与体内AFP残余量及半衰期有关。手术成功则一般AFP在两个月内转阴，AFP异质体将消失。若检测结果显示AFP下降明显但未转为阴性，AFP异质体变化不明显，则提示手术不彻底，癌组织还存在边缘残留或转移等。若AFP异质体下降至25%以下，与AFP水平保持相对恒定，则可能是肝炎或肝硬化所致[18]。

4 AFP异质体的其他应用

4.1在胚胎性肿瘤鉴别诊断中的价值 AFP主要由胎儿的肝细胞及卵黄囊合成[19]，妊娠期妇女体内AFP水平会出现规律性波动，胚胎性肿瘤会造成AFP异常升高，与肝癌较难区分。此时AFP异质体的检测在鉴别诊断中可起到一定作用。相关资料表示，肝癌患者血清中以LCA结合型为主，即AFP-L3占主要部分，而胚胎性肿瘤患者血清以LCA非结合型为主[20]。

4.2在筛查胎儿唐氏综合征(DS)中的价值 DS是新生儿出生缺陷常见的一类遗传性疾病。目前多采用孕中期母血清中AFP、游离β-人绒毛膜促性腺激素(β-hCG)及游离雌三醇等标志物进行产前筛查，但检测灵敏度均较低，只有60%～70%。有研究表明[21]，AFP-L2或AFP-L3在筛查DS方面优于AFP。以AFP-L2、AFP-L3替代AFP并与游离β-hCG建立不同模型分析后结果显示，以AFP-L2+AFP-L3+游离β-hCG筛查DS胎儿的AUC最高[0.929(95%CI:0.861～0.975)]。临界值为1/1 636时，灵敏度、特异度、约登指数分别为0.907、0.857、0.764。

5 AFP异质体与AFP联合检测在PLC中的应用

AFP是PLC的血清标志物，但有部分患者表现为持续性的AFP阴性[22],且AFP受妊娠等多种因素影响，部分良性肝病患者也可存在外周血AFP升高，因此AFP用于诊断存在漏诊、误诊的可能。AFP-L3在肝癌细胞中特异性表达,亓艳[23]等研究表明，AFP-L3单独诊断HCC的灵敏度为56.52%，特异度为90.67%，准确度为79.65%，特异度有所提高，但灵敏度和准确度仍未令人满意。目前临床普遍采用AFP联合AFP-L3对PLC进行诊断，可在保证特异度的基础上大大提高灵敏度和准确度。AFP检测阴性的患者可能AFP-L3检测为阳性，由于两种检测指标存在不完全交叉，所以联合诊断能够弥补单指标检测的不足，提高临床应用价值。

6 结论与展望

AFP-L3对于早期诊断PLC具有十分重要的临床意义，其灵敏度、特异度显著高于AFP[24-26]。为提高PLC检出的正确率和患者生存率，越来越多的AFP-L3联合检测方案被提出，但对于如何采用更好的检测组合，以及简单、快速的实验方法，还有待于进一步研究。