口咽鳞状细胞癌中人乳头状瘤病毒精准检测研究进展

李志鹏 范志伟 王文龙 卜祥斌 张凌楠 马向瑞

(滨州医学院，山东 滨州 256603 1 附属医院口腔颌面外科； 2 口腔医学院； 3 附属医院口腔内科； 4 附属医院口腔正畸科)

口咽部位于软腭和会厌上缘平面之间，借咽峡通向口腔，主要解剖结构包括软腭、舌根(界沟后1/3)、咽侧壁、咽后壁以及扁桃体等[1]。2017年第8版美国癌症联合委员会(AJCC)[2]中TNM分期将口咽鳞状细胞癌(OPSCC)按照有无人乳头状瘤病毒(HPV)感染分为HPV相关性鳞状细胞癌(OPSCC-HPV)和非OPSCC-HPV。近年来OPSCC发病率呈现上升趋势，主要归因于高危型HPV的感染，尤其是HPV16[3]。2018年，美国病理学家协会(CAP)建议把HPV检测作为诊断OPSCC的一项辅助检查[4]。由于人种差异以及文化背景和生活方式不同，各个国家OPSCC患者HPV的感染率不同，我国OPSCC患者HPV的感染率低于20%,而北美地区约为56%，欧洲地区为17%～39%[5]。不同地区人群HPV感染率不同，推荐的检测方法也不相同。如果完全按照国外相关指南或者共识标准化我国检测方案，将会使我国OPSCC-HPV的检出率出现较大差异。因此本文就HPV的分子特性及其独特生物分子标志物检测现状做一总结，以求进一步探索OPSCC-HPV更加特异和灵敏的检测方法。以供实验室或临床借鉴。

1 HPV

HPV在头颈部的研究始于1901年，当时描述了疣状病变通过口交进入口腔并进行传播[6]。随后大量的研究结果证明HPV与头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)，尤其是与OPSCC的发生密切相关。国际癌症研究机构(IARC)分别在2007年和2012年正式调查并分析了HPV对人类的相关影响，并得到了足够的证据表明口咽部确实存在HPV16感染后的致癌性[7]。

HPV是一种无包膜双链DNA病毒，大约有8 000个碱基对，包括200多种亚型，广泛感染人类上皮细胞并引起寻常疣、尖锐湿疣、宫颈癌、肛门癌和口咽癌等疾病[8]。根据与宫颈癌的关系，HPV类型被分为高风险(HPV 16、18、31、33和35型等)和低风险(HPV 26、30、34以及53型等)两种类型[9]。高风险HPV(尤其是16、18型)可极大地促进相关肿瘤的发生，特别是宫颈鳞状细胞癌以及一些其他的生殖器恶性肿瘤等[9]。HPV可以分为3个部分：①早期区包含7个开放阅读框(E1～E7)，于病毒感染早期表达，并在病毒的复制、免疫逃逸和细胞转化中发挥重要作用；②晚期区(L)编码衣壳蛋白L1和L2，该类蛋白参与病毒的包装和释放；③长控制区(LCR)作为调控元件参与病毒转录和复制[10]。当人体感染HPV后，E6与肿瘤抑制蛋白P53结合，并通过蛋白酶介导途径抑制P53的表达，进而抑制其促凋亡功能；E7与成视网膜细胞瘤蛋白(PRb)结合，下调PRb进而促进P16的表达，使相关的细胞周期调节因子无法控制细胞分裂，从而使细胞增殖失控，最终导致肿瘤的发生[11-12]。当然，HPV的致癌机制远非经典途径如此简单。GILLISON等[12]最近研究发现，HPV促癌蛋白会引起宿主基因(凋亡基因、细胞增殖基因和免疫基因等)的不稳定性，形成区别于非OPSCC-HPV的独特基因组，从而促进肿瘤的发生。

2 HPV生物标志物

目前HPV生物标志物主要包括在组织中直接检测病毒的DNA、P16和E6/E7 mRNA，在血清、血浆及唾液中检测抗体、病毒的DNA和E6/E7 mRNA。大多数学者认为应用RT-PCR检测新鲜肿瘤组织中HPVE6/E7 mRNA是诊断转录活跃的高危HPV的“金标准”，其他检测方法灵敏度和特异度的判断也大多与该方法进行比较。但由于新鲜肿瘤组织的获取不适用于所有人群，且RT-PCR技术检测病毒RNA本身也存在一定的局限性，在国内外临床中的应用尚没有普及。因此临床上应对不同检测目的和样本来源选择适合的HPV生物标志物进行研究，以提高病毒的检出率。

2.1 肿瘤组织中DNA水平

对HPV DNA的检测可以直接反应肿瘤组织中是否存在病毒。针对L1序列设计的引物(例如GP5/GP6 引物对)能够扩增多种HPV类型，常被用于检测多种HPV亚型。最新的一项Meta分析结果显示，PCR技术检测肿瘤组织中HPV DNA的灵敏度和特异度分别为98%和84%[13]。但还有一种情况是，病毒整合到宿主基因组后，L1区域可能被删除，从而降低了HPV检测的灵敏度。另外在石蜡包埋组织(FFPE)中，PCR技术也可能无法检测到HPV，因为样本中的基因组序列很可能在甲醛固定、储存过程中被破坏了。同时由于PCR技术本身检测的特点，结果的灵敏度较高，也可能会检测到具有可疑致癌意义的极低拷贝数的病毒，从而增加了假阳性的风险。

DNA原位杂交(ISH)技术是一种利用标记DNA探针与HPV DNA序列互补技术对所有已知类型HPV进行检测的方法。高达10%的OPSCC-HPV是由HPV16以外的亚型引起的，因此鸡尾酒探针对于多种高风险亚型的检测有重要意义。该方法在高倍显微镜下不仅能够直接观测到是否有HPV DNA，还有助于确定HPV DNA在组织和细胞中的位置，进而显示病毒的状态(扩散信号表明存在游离型HPV，点状信号表明存在整合型HPV)，从而提高了检测的特异度。然而，由于缺乏清晰的染色信号，检测人员主观判断所导致结果的差异可能高达10%。总的来说，应用PCR或ISH技术检测组织或者细胞中的HPV DNA都不能确定HPV是否具有活性[5]。

2.2 肿瘤组织中RNA水平

相对于HPV DNA，HPVE6/E7 mRNA的检测结果更加准确，RT-PCR针对不同HPV的E6/E7设计合适的引物，进而分析病毒的亚型和评估病毒的毒性。然而，该技术操作难度较大，对结果的解释也可能存在主观判断，故不适用于常规的病理实验室[13]。类似于DNA ISH，E6/E7 mRNA ISH也是采用鸡尾酒探针的方法，从各种HPV亚型中对E6/E7 mRNA进行检测。目前常用的RNA-scope方法可以直接显示常规处理组织中的病毒mRNA，并且能识别HPV在细胞中的位置，从而提高了检测的特异度[14]。UKPO等[14]通过免疫组织化学(IHC)方法检测肿瘤组织中的P16，结果与E6/E7 mRNA ISH的一致性达到了96.4%，与DNA ISH的一致性仅为79.3%，这也进一步说明E6/E7 mRNA ISH的灵敏度是优于DNA ISH的。

无论哪种方法检测RNA都要考虑到：①FFPE样本中RNA可能受到污染或破坏。②生物体液样本中含量较低的RNA可能会影响检测结果。

2.3 肿瘤组织中蛋白水平

P16是一种肿瘤抑制蛋白，通过抑制CDK4和CDK6的磷酸化来调节细胞周期，从而阻止PRb的磷酸化。在HPV的生命周期中，E7可使PRb失活，从而导致P16等细胞周期相关蛋白的上调且达到IHC容易检测的水平，因此P16的上调可以作为活跃的HPV感染的标志。由于低成本、易获取、高灵敏度以及较高的观察一致性，国外很多学者倾向于把P16作为OPSCC中HPV感染的替代标志物。ABDELHAKAM等[15]针对104例OPSCC患者进行回顾性研究，发现肿瘤组织中P16阳性率达到了89.4%。然而也有一些研究指出，P16的高表达并不能反映HPV的转录活性，因为其升高还受到其他非致癌机制的调控，如与HPV无关的神经干细胞以及良性鳞状细胞也可以过度表达P16。TRIBIUS等[16]研究显示采用IHC方法检测肿瘤组织中P16大约有5%假阳性风险。P16作为HPV感染的替代指标是否可靠在国内外一直备受关注，但因我国HPV感染率较低，特异度较低的诊断标志物作为独立检测指标是不可靠的。故在不同地区需重新评估P16 IHC的诊断能力[5]。

2015年，CHI等[17]推荐以下方案来评估HPV的状态：①对于完全或大部分非角质化的肿瘤，P16高度且弥漫(即70%以上细胞质和细胞核)表达时，足以指示HPV阳性，不需要再进行HPV DNA检测；若P16阴性或者局部阳性表达时，则需要进行HPV DNA检测；②对于角质化肿瘤，P16高度且弥散表达时，需要进行HPV DNA检测；若P16阴性或局部阳性表达时，足以指示HPV的阴性状态，不需要HPV DNA检测。

2020年我国《口腔癌及口咽癌病理诊断规范》中对于OPSCC患者提出了具体的推荐诊断方案。Ⅰ级推荐：所有病例均应行P16 IHC检测，当 P16阳性细胞数≥70%、阳性表达定位于细胞核和细胞质且为中等至强阳性，且组织学形态为非角化型鳞状细胞癌时，应报告“HPV相关性(P16+)鳞状细胞癌”；Ⅱ级推荐：除行 P16 IHC检测外，可行 HPV DNA或RNA检测，对于HPV DNA或RNA检测阳性者，应报告“OPSCC-HPV”。

2.4 体液中的生物标记物

血清、血浆和唾液中生物标记物在可获得性、低侵入性、低成本性等方面具有优势，对其检测有助于疾病早期和术后复发的预测。一种基于PCR的检测唾液中HPVE6/E7 mRNA的方法，检测结果与P16 IHC具有高度一致性。RETTIG等[18]收集了OPSCC-HPV患者治疗前后几个时间点的唾液样本，54%的患者在诊断时被检测到HPV DNA，而经治疗后仅约5%患者唾液中可检测到HPV DNA。重要的是，所有治疗后复发OPSCC-HPV患者均与HPV持续感染相关[18]。

研究发现HPV E6/E7血清抗体与OPSCC风险之间具有显著相关性。KREIMER 等[19]研究发现，有34.8% OPSCC患者血清中被检测到HPV E6抗体，而在健康对照组中仅占0.7%，值得关注的是部分诊断为OPSCC患者在10年前血清中就已检测出存在HPV E6抗体。这可能意味着血清中HPV16 E6抗体阳性人群患OPSCC风险较高。

AHN等[20]应用PCR方法检测了81例OPSCC-HPV患者的血浆，约有67%的样本在治疗前就检测到了HPV DNA。CHERA等[21]利用相同技术对115例患者的1 006份血浆样本进行了检测，87例患者在治疗后监测期间内未检测到HPV DNA，并且均未出现复发；28例患者在治疗后监测期间检测到HPV DNA，其中15例患者经活检证实复发；16例患者连续2次HPV DNA血浆检测阳性，其中15例经活检证实复发。这些数据对于早期发现肿瘤复发和开展进一步治疗非常有帮助。

3 结语

生物标志物是指可以提示系统、器官、组织、细胞及亚细胞结构或功能的改变或可能发生改变的生化指标，具有非常广泛的用途。检测一种疾病特异性的生物标志物，对于疾病的鉴定、早期诊断、预防和治疗有着至关重要的作用。因为具有成本更低、样本更易获取和大众更易接受的特点。针对唾液、血浆中HPV DNA和血清中HPV抗体的检测，比较适用于临床大规模的筛查和复发预测，然而其检测结果灵敏度偏低，这可能与液态样本中病毒含量较低或者检测技术不成熟等有关。目前针对组织样本的检测主要有PCR、ISH和IHC等技术。检测方法各有利弊，也没有足够的证据证明仅采用一种检测方法就可以确诊。这里需要注意的是，要将一种检测方法应用于临床实践，需要的不是灵敏度高到可以检测到少量HPV(可能来自无关的感染或污染)，而是要证明病毒的转录活性是否已经可以导致癌症，同时要结合 OPSCC-HPV 临床表现。因此，当前较多学者提出了多模态检测，其原理是利用单个检测的优势来优化HPV检测结果整体可靠性。

总而言之，未来OPSCC-HPV的检测应该满足非侵入性、低成本及易操作的特点，从而做到早诊断、早治疗，以提高患者的总体生存率。