细胞因子检测在急性移植物抗宿主病诊治中的临床应用

细胞因子是一组激素样多肽介体，在介导宿主免疫防御中发挥重要的调节作用。细胞因子可由不同类型的细胞产生，起到细胞间信号传递、增强或抑制目标细胞增殖、分化、活化和运动的作用。

造血干细胞移植(HSCT)是治疗血液系统疾病的重要手段之一。移植物抗宿主病(GVHD)是移植后的常见并发症，是引起HSCT后死亡的重要原因。GVHD是指患者在接受造血干细胞移植后，由于供体移植物中的免疫活性细胞T淋巴细胞与体内组织间发生特异性免疫反应，从而导致受体的靶组织或靶器官受损。临床上GVHD可分为移植后100 d以内及100 d之后的急性GVHD(aGVHD)和慢性GVHD(cGVHD)。研究发现,辅助T淋巴细胞中Th1和Th2亚群所分泌的细胞因子失衡会导致GVHD的发生，从而对该疾病的分层诊断、预后判断及靶向治疗产生影响。因此，对于患者体内特异性细胞因子的检测分析可能会为GVHD的防治提供线索和思路[1]。

由于GVHD不仅会引起全身性免疫疾病，而且还会影响皮肤、胃肠道和肝脏等的功能。aGVHD引起的不同靶器官受损的临床症状缺乏特异性，需要与感染、药物等其他原因相鉴别。血清生物学标志物检查是一种简便易行的aGVHD诊断和评估的重要手段，其生理学研究也有利于进一步了解aGVHD的发病机制。因此，利用生物标志物，特别是具有特异性的细胞因子在aGVHD的诊断、预后评估及靶向治疗方面值得深入探索。目前，关于aGVHD的细胞因子研究相对较多，本文对此进行综述。

1 细胞因子检测在aGVHD诊断中的价值

aGVHD按3个靶器官受损程度分为Ⅰ～Ⅳ度。aGVHD首先出现的免疫反应发生在移植后的几周内，对于重度的aGVHD若能进行早期诊断和干预，会减轻靶器官的损伤，并提高移植成功率。病理活检是一项有创检查，虽然作为诊断GVHD的“金标准”，但是临床上大多数患者无法耐受该项检查，所以能筛选出早期诊断aGVHD及预测aGVHD发生严重程度的生物标志物尤为重要。目前研究集中在具有预测性的生物标志物上，但生物标志物能否替代进行诊断还需临床研究的不断佐证，以下几种细胞因子目前比较受关注。

1.1肿瘤坏死因子α(TNF-α) TNF-α在aGVHD的作用机制是通过一连串的放大效应，激活供体T细胞，引起一系列“细胞因子风暴”，从而对宿主靶组织或靶器官产生直接杀伤毒性，进一步导致机体的损伤。MIR等[2]通过对比aGVHD的患者与移植后未表现aGVHD患者之间的内皮损伤程度并检测TNF受体1(TNFR1)后发现，从移植后的第7天开始，TNFR1水平能够预测该并发症的发生。在发生aGVHD的患者中，若TNFR1持续高表达，可考虑行TNF-α预防性的阻断治疗，以降低重度aGVHD的发生率。同时，研究表明，TNFR1对提示患者是否存在激素耐药状态有一定的参考价值[3]。但单独的TNFR1作为诊断aGVHD的依据尚不足以准确预测疾病的发生，而将其与其他生物标志物组合之后的系统评估可能会增强其作为诊断依据的能力[1]。

1.2白细胞介素2受体(IL-2R) 研究表明，aGVHD的发生是由于预处理引起的肠道黏膜损伤，使脂多糖(LPS)从肠道进入外周并诱发“细胞因子风暴”，造成受者体内产生大量的炎性细胞因子释放，受者体内的抗原提呈细胞(APC细胞) 激活，并为供者T淋巴细胞的激活提供共刺激信号，进而增强供者T淋巴细胞的免疫反应，形成组织炎症，最终导致靶器官损伤[4]。由于炎性细胞因子在激活T淋巴细胞中起重要作用，激活的T淋巴细胞表达IL-2R。有研究显示，IL-2和可溶性IL-2R(sIL-2R)在GVHD的发病机制中均起着核心作用，在移植后出现疾病的患者中，其血液中早期的sIL-2R水平与Ⅱ～Ⅳ级GVHD和移植相关死亡的发生率密切相关[5]。同时，BERGER等[6]研究证明，IL-2R和肝细胞生长因子(HGF)与Ⅱ～Ⅳ级和Ⅲ～Ⅳ级aGVHD发生相关，大多数发展为重度aGVHD的患者在其移植后早期即可显示出高水平的sIL-2R，表明移植早期sIL-2R水平可以作为aGVHD严重程度的预判指标。

1.3肿瘤抑制素2 (ST2) ST2是IL-1 受体家族的新成员，也称为IL-33受体(IL-33R)，目前其唯一已知的配体是IL-33[7]。而ST2基因通过交替剪接产生2种不同的产物,即膜结合型(mST2)和可溶型(sST2)。mST2主要表达于造血细胞中，特别在Th2介导的疾病(如哮喘)中起重要作用。sST2可作为IL-33的诱骗受体，驱动Th2细胞向Th1细胞变化，这些机制能更加清晰地解释aGVHD的病理、生理发展过程[8]。有研究发现，ST2可进一步在不同严重程度的aGVHD患者中不受其他因素影响而表现出独特的差异性[7]。因此，MCDONALD等[9]将发生aGVHD的患者，以sST2的不同表达水平分为4组，结果发现，具有较高表达水平的sST2患者和Ⅲ～Ⅳ度aGVHD患者的非复发死亡(NRM)显著增高，同时，高表达水平的sST2患者NRM也显著高于低表达水平的sST2患者。VANDER等[8]研究显示，通过蛋白质组学方法，将高ST2水平鉴定为与难治性aGVHD最相关的生物标志物。所以，sST2可以作为确诊重度aGVHD和预测NRM的重要生物标志物。

1.4干细胞生长因子(HGF) HGF最初被鉴定为是一种可促进肝细胞增殖的有丝分裂原。HGF是受体酪氨酸激酶c-met原癌基因产物的配体，是一种多功能生长因子，可影响多种细胞。同时，HGF也具有多种生物学作用，包括促进有丝分裂、抗凋亡、血管生成等[10]。通过对不同严重程度的GVHD患者的血清进行分析发现，不仅在发生aGVHD的患者中HGF存在显著差异，而且血清HGF可预测aGVHD的发病严重程度及1年NRM[11]。所以通过对移植后患者HGF水平的连续检测，可以有效预测患者GVHD的发病严重程度，便于进行及时干预。

1.5皮肤源性弹性蛋白酶抑制剂(SKALP) SKALP是由介导GVHD的炎性因子诱导产生的。最早被发现在发炎的表皮过表达。MAHABAL等[12]研究显示，利用免疫组织化学法检测技术，通过连续6个月对行HSCT的患者进行诊断分析关于皮肤相关aGVHD的SKALP水平变化后发现，SKALP预测aGVHD的灵敏度和特异度分别为100%和75%。SKALP也是区分皮肤相关aGVHD与其他皮疹疾病(如病毒、药物等引起)的最优鉴别因子[13]。而且，SKALP在皮肤相关aGVHD患者中的水平会随着其临床诊断评分的增加而上升[14]。但也有研究发现，在接受移植后100 d内的相同时间点，对是否有aGVHD表现的患者血清进行分析，其血清中的SKALP水平并未发现显著差异，该研究认为SKALP是皮肤相关aGVHD的特定生物标志物，因为并非所有aGVHD患者都有皮肤症状，并且一些没有aGVHD的皮疹患者也显示SKALP高表达[3]。说明SKALP在皮肤相关aGVHD患者血浆中的水平可以较特异地预示患者的严重程度。

1.6转化生长因子β(TGF-β) 研究发现，aGVHD患者血液TGF-β水平有所降低[15]。有研究通过对不同GVHD分级的患者血浆进行分析发现，aGVHD患者TGF-β总水平下降，其中Ⅲ～Ⅳ级aGVHD患者的TGF-β水平明显高于Ⅰ～Ⅱ级 aGVHD患者，表明TGF-β可作为aGVHD严重程度的参考指标[3]。在患者造血干细胞移植早期，供体T淋巴细胞中的Treg是TGF-β的主要来源，并且能够以TGF-β依赖性的方式减弱aGVHD的临床表现。但尚不清楚较低水平的TGF-β是否由aGVHD中调节性T细胞(Treg)的减少引起，因为供体来源的Treg不是TGF-β的唯一来源[15]，所以，一般不将TGF-β作为aGVHD诊断相关的生物标志物使用。

1.7内毒素受体Toll 样受体4(TLR4) Toll样受体(TLR)是表达在抗原呈递细胞(如巨噬细胞、树突状细胞)表面的一系列跨膜蛋白。TLR4是内毒素LPS识别多种类型的病原体相关分子模式(PAMPs)或损伤相关分子模式(DAMPs)的生物分子，可诱导核因子κB(NF-κB)信号通路，是T淋巴细胞活化和分化所必需的刺激分子(如促炎性细胞因子TNF-α)，最终可触发GVHD的发生[16-18]。研究发现，TLR4在不同程度的aGVHD患者中有显著差异，可作为评价aGVHD严重程度的指标[3]。通过对激素耐药型aGVHD患者和激素敏感型aGVHD患者进行对比研究发现，TLR4也有显著差异。所以，TLR4作为生物标志物对aGVHD患者的诊断可能具有较大意义。

2 细胞因子检测在GVHD预后评估中的作用

HSCT是血液肿瘤最有效的治疗方法之一，虽然HSCT可以诱导移植物抗肿瘤/白血病(GVT/L)效应，但GVHD是患者整体生存(OS)的不利因素，甚至导致死亡，GVHD是移植患者非复发死亡的重要原因。由于生物标志物在GVHD的诊断中具有重要的参考价值，生物标志物研究也成为评估预后的研究方向之一。

有研究收集492例aGVHD患者，使用竞争风险回归等统计学方法，将TFNR1、ST2和再生胰岛衍生蛋白3α(REG3α)的表达水平模拟分为3种预测分数，发现可以有效预测出不同患者在完全缓解(CR)或部分缓解(PR)情况下对治疗的反应、NRM及OS[19]。但其研究的局限为当评分处于极端值时(评分为1或3)，该算法对疾病预后相关评估的可靠性受到限制。

对于上述预后评估算法中涉及的细胞因子，均涉及胃肠道相关症状的部分发生机制。其中TNF-α参与机制在上一部分的描述中已有提及，由于移植或预处理等因素介导受体产生促炎因子，其中也包括抗原呈递细胞(APC)的生成增多，继而供体T淋巴细胞于宿主APC反应后激活，使得细胞内生化级联反应增强而导致TNF-α等大量的Th1细胞因子增加。最后这些细胞因子进一步与细胞毒性T淋巴细胞等发生协同作用而对局部组织产生损伤。在这类细胞因子中，TNF-α对胃肠道形成特异性损伤，通过对TNF-α的抑制可以明显减轻GVHD小鼠模型中胃肠道相关症状的严重程度。sST2的分泌水平在胃肠道相关症状中的表现多与炎症性肠病的发病水平类似[20]，sST2可以作为IL-33诱骗受体从而阻断IL-33在其相关疾病中的信号传导。而Treg在肠道中大量存在，并且可以防止在自身和环境中对炎性反应失调。但在慢性肠道炎症期间，大量存在的sST2可能通过抑制IL-33参与的信号传导来抑制Treg的产生，并将进一步减弱对疾病的自身调控作用[21]。

临床研究发现，参与aGVHD病理、生理变化过程的细胞因子在一定程度上可以反映疾病的预后情况。但是由于样本量或多因素相关分析的相互干扰，使得单一种类的细胞因子对疾病的诊断或预后评价受到限制。因此，应用细胞因子组合来提高特异度是一种有效的解决方法。采用TFNR1、ST2和REG3α相关的算法作为评分来预测疾病的NRM，不仅可以区分GVHD患者的严重程度，还可以预测是否有相关的靶器官损伤[19]。有研究通过对40例接受异源性HSCT治疗的患者，分别在表现出aGVHD(n=20)和无aGVHD(n=20)的2组患者血清中比较发现，由SKALP、TLR4、TGF-β和TNFR1组成的评估小组不仅可用于aGVHD诊断及患者临床表现分级，也可以预测表现出aGVHD的患者在接受激素治疗后是否表现为灵敏[19]。未来对于细胞因子等生物标志物的研究，可以聚焦提高诊断的特异度，提前预测疾病的发展、转归和指导疾病靶向治疗，最终推动精准医疗的发展。

3 细胞因子作为靶点在aGVHD的治疗现状

糖皮质激素是aGVHD的一线治疗方案，而糖皮质激素治疗失败后产生激素耐药型的aGVHD(SR-aGVHD)尚无统一的二线治疗方案。在一项GVHD效应相关的多种细胞因子靶向单抗或免疫抑制剂进行aGVHD治疗的报道中，缓解率约为60%[22]，表明SR-aGVHD的治疗取得了进展。

当患者发生aGVHD时，供体的T淋巴细胞与其体内的抗原呈递细胞发生特异性结合导致供体的反应性T淋巴细胞被激活并增殖，然后转移至靶器官和靶组织，同时伴随着大量的细胞因子释放从而加重aGVHD的过程。IL-2是Th1细胞因子中的“骨干”，其作用主要包括免疫反应的扩增、T细胞及NK细胞的活化、巨噬细胞TNF-α的分泌和皮肤、胃肠道的损伤。研究发现，使用高剂量IL-2治疗的aGVHD小鼠较低剂量治疗小鼠的病死率更高。KENNEDY-NASSER等[23]研究发现,如果使用超低计量(10×104/U)IL-2进行治疗可明显增加体内的CD4+CD25+FoxP3+Treg，而不会引起GVHD或使细胞介导的对病毒或白血病抗原的反应能力丧失，而同时扩增的Treg细胞可产生有效的免疫抑制作用，降低供体反应性T淋巴细胞活化引发的aGVHD损伤[24]。作为另外一种Th1细胞因子，IL-10可通过下调IL-2来调节CD4+T淋巴细胞的功能，影响GVHD的发病过程。WEBER等[25]研究发现，IL-10敲除的宿主小鼠的生存时间较对照组更短。在对GVHD进行治疗时，已有研究证明使用TNF-α拮抗剂可减弱炎性反应，不会影响植物抗白血病效应[26]。同时，在使用抗TNF-α单克隆抗体英夫利昔单抗时，有研究发现，英夫利昔单抗治疗类固醇难治性aGVHD的疗效，总体反应率为15%～100%，在胃肠道和皮肤aGVHD中观察到最高的反应率[27]。所以，SR-aGVHD的患者接受抗TNF-α单克隆抗体治疗可以起到不错的效果[28]。

sST2作为GVHD的预后生物标志物可预测SR-aGVHD的非复发死亡率[8]。RAMADAN等[29]研究发现，使用人源性T淋巴细胞注入经过300 cGy全身照射(TBⅠ)预处理的NSG小鼠模型中，检测人sST2在血清中的水平。通过使用不同计量的小分子ST2抑制剂(ⅠST2)与使用二甲基亚砜的对照组进行比较，发现除了高水平(40 mg/kg)实验组及对照组外，低、中水平(5、10 mg/kg)实验组使用ⅠST2后可降低sST2的水平。并且，GVHD评分可同时降低，存活率显著提高，可以维持移植物抗白血病效应。同时，该研究小组在另一项研究中也发现，在建立aGVHD的小鼠模型中，对比只接受辐射或接受同源T淋巴细胞的对照组，其血清sST2水平与人类患者相似[20]。他们使用了针对鼠类ST2(抗ST2单抗,CNT03914)和适当的对照同种型Ab(ⅠgG)的单克隆抗体同时对建立aGVHD的小鼠模型进行治疗，发现在抗ST2 单抗治疗的小鼠中，小肠、大肠和肝脏(主要aGVHD靶器官)的组织病理学评分均显著改善，同时其存活率也显著提高。

通过将转染了人类HGF cDNA的HVJ脂质体(HGF-HVJ脂质体)反复注入出现aGVHD的小鼠模型，HGF基因表达后，aGVHD的表现可受到抑制。通常认为，HGF对于预防肠道GVHD发挥重要作用，主要通过以下机制来影响aGVHD的进展：IL-2作为诱导GVHD中Th1相关的关键细胞因子，在移植期间阻断IL-12的产生，降低供体移植物的排异反应。而最初来自于供体的同种反应性T淋巴细胞会诱导胃肠道上皮的损伤，这将引发肠腔的内毒素进入黏膜和黏膜下层组织并进入全身循环。释放入血的内毒素将进一步激活巨噬细胞分泌IL-12，进而刺激T淋巴细胞产生γ干扰素。同时，γ干扰素也使受到内毒素刺激的巨噬细胞产生更多的IL-12。而研究表明， HGF通过抑制GVHD小鼠IL-12水平发挥对肠上皮细胞的抗凋亡作用来防止胃肠道aGVHD损伤[30]。

4 展 望

细胞因子作为特异性生物标志物已经被应用于aGVHD的诊断、预后评估及靶向治疗。因其检测便利性和技术手段不断提升，可以利用细胞因子的优势来弥补传统方法诊断的滞后性，减少误诊、漏诊率。但是，也应该看到，细胞因子检测在aGVHD上还需要提升其特异度和灵敏度，与感染等疾病进行有效鉴别；寻找更加简便易行的细胞因子组合等。同时，由于统计学手段的提升，可以很大程度地推进现阶段对疾病诊疗模式的探索，在疾病发展的早期进行诊断，通过提前干预减缓或终止疾病的进展，从而减轻因疾病带来的损伤。细胞因子作为具有前景的研究方向，值得在aGVHD领域进一步深入研究。