叶酸与不良生育的相关研究

胡浩梅，杨华

叶酸（维生素B9）是人体内重要的营养素之一，其参与DNA 的合成和甲基化，帮助氧化损伤修复、参与蛋白质代谢，另外还与维生素B12 协同促进红细胞的生成及成熟。因此，体内叶酸摄入不足或代谢异常均会造成多种发育相关基因和通路的调控异常，进而导致多种疾病及妊娠妇女生育不良。在我国有不良生育史的妊娠妇女占10%～15%。不良生育主要包括稽留流产、复发性自然流产、宫内死胎及各种胎儿畸形等。此外，我国每年新生缺陷儿高达80 万～120 万人，是出生缺陷发生率较高的国家。近年来，叶酸是否是导致不良生育的原因成为研究热点。目前许多研究表明叶酸摄入不足、吸收障碍或代谢异常与某些不良生育有关，故本文就叶酸与不良生育相关性研究进展进行综述。

1 叶酸的转运和吸收

叶酸是水溶性B 族维生素，是促进人体健康的一种重要维生素。主要存在于绿叶蔬菜、水果、豆类、坚果及肉类等食物中，人体不能自身合成，只能从饮食中获得。饮食中摄取的叶酸主要以多聚谷氨酸盐的形式存在，必须经过水解才易于被转运。这是叶酸代谢的第一步，发生在肠黏膜上。叶酸被人体转运及吸收主要通过3 种转运体，即质子偶联叶酸载体、还原叶酸转运体及叶酸受体，其中叶酸受体α最为重要。有文献报道，小鼠叶酸受体α 表达异常与神经管缺陷、颅面畸形及心脏发育异常等有重要相关性[1]。

2 叶酸代谢及相关酶基因多态性

叶酸在体内通过二氢叶酸还原酶还原成四氢叶酸（THF），THF 通过5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）催化形成5-甲基四氢叶酸。5-甲基四氢叶酸作为一碳单位的供体不仅参与DNA 的合成，而且做为甲基供体还为同型半胱氨酸（Hcy）再甲基化提供甲基，从而形成甲硫氨酸，进一步参与DNA 甲基化，并参与蛋白质和脂类的合成代谢。

叶酸代谢过程中有多种酶参与，其中MTHFR是最为关键且重要的酶。MTHFR 位于1 号染色体1p36.3 位置，研究证实MTHFR 具有多态性，该多态性会导致酶的耐热性及活性降低进而导致其功能下降。近年研究发现，MTHFR 发生多态突变位点已达到近20 种，其中最重要的突变位点是C677T 及A1298C。MTHFR 677 的突变方式为胞嘧啶变异为胸腺嘧啶，从而使编码的缬氨酸变异为丙氨酸。MTHFR 677 位点有3 种基因型，分别为CC 型、CT型（杂合突变型）及TT 型（纯合突变型）。文献报道MTHFR 677 多态性基因型分布及其致病性受种族及地区的影响[2]。研究显示我国人群中CC、CT 及TT型分布频率分别为33%、44%及23%，且3 种类型对应的酶活性分别为100%、65%、25%[3]。此外，MTHFR 1298 位点的胞嘧啶替代了腺嘌呤，引起其编码的丙氨酸替代了谷氨酸，造成酶活性降低。MTHFR 1298位点有3 种基因型，分别为AA 型、AC 型（杂合突变型）及CC 型（纯合突变型）。文献报道在我国人群中AA、AC 及CC 型分布频率分别为67%、28%及3.9%，其对应酶活性分别为100%、82%、60%[3]。另外有文献报道，中国人同时出现MTHFR 677 TT 型和MTHFR 1298 CC 型的概率仅为1%，其对应的酶活性仅为15%[4]。

叶酸代谢的另一关键酶是甲硫氨酸合成酶还原酶（MTRR）。MTRR 基因位于5 号染色体5p15.2～15.3 位置，MTRR 能还原甲硫氨酸合成酶的活性，从而催化产生甲硫氨酸。甲硫氨酸在蛋白质和一碳代谢过程中发挥重要作用，是其代谢过程中的必须氨基酸。MTRR 66 位点是目前研究最多的位点，其腺嘌呤突变为鸟嘌呤，导致MTRR 酶活性降低，进而影响叶酸代谢。研究显示，汉族人群中MTRR 66 GA 和MTRR 66 GG 分布频率分别为25.7%和6.6%[4]。

3 叶酸代谢异常导致不良生育

叶酸代谢相关酶的基因多态性造成酶活性下降，影响叶酸正常代谢，干扰人体正常生理代谢过程，可导致多种疾病，其中导致不良生育的相关研究被广泛报道。

3.1 可导致早期自然流产孔梅等[5]在探讨叶酸代谢相关酶基因多态性与胚胎停育的相关性研究中选取114 例有胚胎停育史和125 例正常妊娠妇女为研究对象，分别检测2 组的MTHFR、MTRR 等位基因及基因型分布情况。结果显示，胚胎停育组MTHFR C677T 的T 等位基因分布与对照组相比差异有统计学意义（P＜0.05）；胚胎停育组MTHFR C677T 的TT基因型和MTRR A66G 的GG 基因型所占比例高于对照组（P＜0.05）。Logistic 回归分析显示，MTHFR C677T 的TT 基因型和MTRR A66G 的GG 基因型是胚胎停育的高危因素，其发生风险分别是对照组的4.12 和4.52 倍。Mo 等[6]在MTHFR A1298C 多态性与中国人群不良妊娠结局关系的研究中发现，MTHFR 1298 基因型分布在中国有地域差异，AA 型分布频率在中国人口中有由北至南、由东至西的下降趋势，并得出结论：在中国MTHFR 1298 CC 基因型是造成不良生育基因方面的一个重要因素。Nowak 等[7]在一项波兰人口复发性流产与MTHFR 基因多态性相关性研究中发现MTHFR C677T 的C 等位基因是防止复发性流产的保护性因素。而复发性流产夫妇中MTHFR 1298 基因型女性和男性组合为AA/AC 者所占比例更高。通过阅读大量文献，笔者发现目前研究大多认为MTHFR C677T 的T 等位基因突变是导致复发性流产的重要相关因素，而MTHFR A1298C 及MTRR A66G 基因多态性与复发性流产是否相关意见不同，需进行更深入的研究。

3.2 可导致男性不育研究发现男性MTHFR 基因多态性会造成少弱畸形精子症，导致男性生育能力降低。蔡丽伟等[8]在男性不育研究中发现不育组MTHFR C677T 中T 等位基因频率显著高于对照组，不育组MTHFR C677T CC 型频率显著低于对照组，TT 型显著高于对照组。吴正沐等[9]回顾分析285 对不孕不育夫妇，对男方精液质量、血清Hcy 水平和MTHFR 基因型等资料进行分析，根据Hcy 水平分为高Hcy 组和正常Hcy 组，根据MTHFR 基因型分为TT组和非TT 组，两两组合，以非TT 正常Hcy 组为对照组。结果各组精液质量比较差异无统计学意义，TT及非TT 高Hcy 组受精率显著降低。故认为高Hcy血症可能会影响辅助生殖技术的受精率。Xie 等[10]在探讨MTHFR C677T 多态性与少弱精子症以及补充叶酸对精液质量影响的相关性研究中发现，低弱精子症组CT 及TT 基因型频率明显高于健康对照组，低弱精子症组的血清Hcy 水平明显高于对照组。低弱精子症患者在补充叶酸3 个月后精子密度显著增加，尤其是携带TT 基因型者增加最明显。

3.3 可导致新生儿出生缺陷

3.3.1 导致胎儿神经管缺陷（NTDs）NTDs 包括无脑儿、脊柱裂、脑脊膜膨出和脑膨出等。许多研究证实，叶酸缺乏是导致胎儿NTDs 的重要原因之一，补充叶酸可以有效预防NTDs 发生，这点已得到广泛认可。2006 年MTHFR 是第一个被证实为与先天性脊柱裂相关的遗传风险因素[11]。Valentin 等[12]认为叶酸缺乏是NTDs 的诱发因素，多项随机对照试验表明，高剂量叶酸（4 mg）是预防NTDs 复发的重要因素，低剂量叶酸（0.4 mg）可显著预防NTDs 的首次发生。其他原因可能增加新NTDs 的发生，如MTHFR多态性、抗癫痫治疗、肥胖和糖尿病等。张春红等[13]在探讨中国母亲MTHFR 基因多态性与子代NTDs相关性的Meta 分析中得出结论：中国育龄女性MTHFR 基因C677T 多态性是子代发生NTDs 的重要危险因素，基于MTHFR 基因检测的孕期补充叶酸是降低NTDs 的重要手段。国外最新综述表明补充叶酸是预防NTDs 的重要方法，但过量补充叶酸可能会导致后代健康异常，如免疫病、自闭症、脂代谢紊乱等，故基于叶酸检测后的补充指导很重要[14]。3.3.2 导致胎儿非综合征性唇腭裂 杨娟等[15]在胎儿非综合征性唇腭裂发生危险因素的研究中得出结论：孕妇早孕期不良接触史、感染史、用药史、叶酸摄入不足、唇腭裂家族史及MTHFR 基因突变是非综合征性唇腭裂发生的危险因素。印度一项随机对照研究表明唇腭裂家族史、完全素食、孕妇高龄是唇腭裂的高风险因素，而孕早期补充叶酸不降低唇腭裂发生的风险[16]。郭思远等[17]研究发现EPHA3 基因、孕早期叶酸摄入及其相互作用与非综合征性唇腭裂的发病相关。近3 年来此类研究较少，故叶酸代谢异常与非综合征性唇腭裂是否相关仍需要更深入的研究。

3.3.3 导致新生儿先天性心脏病（先心病）先心病主要包括房室间隔缺损、法洛四联症和动脉导管未闭等。Xu 等[18]对47 篇文献进行Meta 分析，结果显示MTRR、MTHFR 多态性可能是黄种人和白种人发生先心病的高风险因素。Elizabeth 等[19]研究认为血清低叶酸、高Hcy、儿童及其母亲中存在基因遗传多态性是先心病的危险因素。营养和基因的相互作用是可以被改变的一种高危因素。建议补充叶酸和维生素B12 作为先心病的一级预防。还有研究显示MTRR 66 的AG、GG 基因型与儿童室间隔缺陷有明显相关性。妊娠妇女MTRR 和MTR 基因均变异时胎儿发生先心病的风险增高[20]。

3.3.4 导致新生儿唐氏综合征1999 年James 等[21]首次提出叶酸代谢异常与新生儿唐氏综合征具有相关性。柴鸥等[22]在MTHFR 多态性与唐氏综合征相关性研究中发现，MTHFR C677T 和A1298C 的基因多态性可能与唐氏筛查高风险有一定关系，携有C-C或T-C 单体型孕妇筛查唐氏阳性风险的可能性增加。最新研究发现，MTRR A66G 基因位点发生GG突变，可增加女性唐氏儿发生率，如同时伴有MTHFR C677T 位点TT 突变者，其不良生育风险将会进一步升高[23]。

3.4 可导致妊娠期高血压疾病卜春艳等[24]在MTHFR 基因多态性及孕期补充叶酸与子痫前期发病风险的相关性分析中得出结论，子痫前期发病风险与MTHFR C677T 多态性及补充叶酸有关，在子痫前期高风险的孕妇中进行该基因筛查并依据结果及时补充叶酸有预防子痫前期发生的可能。Seremak-Mrozikiewicz 等[25]对120 例健康孕妇和98 例子痫前期孕妇进行分析发现，MTRR A66G 的GG 基因型突变孕妇体内甲基多巴增高、新生儿出生体质量偏低、胎盘质量高，易导致子痫前期发生。

4 叶酸代谢异常导致不良生育的原因

叶酸代谢异常可使体内Hcy 水平增高，并影响DNA 的甲基化和DNA 的合成及修复，对妊娠期妇女造成不良影响。

4.1 高Hcy 血症 体内Hcy 主要通过2 条途径代谢，即再甲基化途径和转硫途径。再甲基化途径：约50%的Hcy 接受5-甲基四氢叶酸提供的甲基，重新合成甲硫氨酸；转硫途径：另约50%的Hcy 通过维生素B6 的催化不可逆生成半胱氨酸和α 酮丁酸。MTHFR C677T 基因突变会导致酶活性降低，影响5-甲基四氢叶酸合成，Hcy 再甲基化障碍，使Hcy 在体内蓄积，引起高Hcy 血症。MTRR 是叶酸及Hcy 代谢的另一重要因素。MTRR 催化还原MTR，使Hcy再甲基化生成蛋氨酸。MTRR A66G 基因突变致使酶活性下降，Hcy 再甲基化障碍，也可导致高Hcy 血症。

研究指出，叶酸缺乏和高Hcy 血症与某些不良妊娠事件有关。孕早期高Hcy 血症可抑制绒毛膜的形成，减少绒毛的血管数量，减少胚胎的血流灌注，进而导致胚胎着床不良，造成胚胎停育及自然流产。Hcy 水平升高损害血管内皮细胞，增加血栓的风险。孕期血栓是造成自然流产及妊娠高血压综合征发生的高危因素。同时，Hcy 对胚胎的毒性也会随浓度的增加而增大。Hcy 作用于胚胎神经细胞，还可引发先天畸形。资料证实孕期母体Hcy 浓度升高是诱发NTDs 的重要原因。李丹等[26]在Hcy 诱导鸡胚NTDs实验中得出结论：高Hcy 血症有胚胎毒性并可致NTDs。有研究报道高Hcy 血症影响胎儿心脏神经嵴细胞生长分化，引起心肌细胞凋亡，导致胎儿先心病的发生。此外高Hcy 引起心脏发育异常还因为Hcy导致细胞高氧化应激，进而对线粒体及DNA 造成损伤，导致基因表达产物异常[27]。高Hcy 血症对男性生育产生影响是因为高Hcy 可造成精子DNA 损伤，还可诱发其自身氧化应激，损害精子细胞膜，导致精子活力下降[28]。

4.2 DNA 低甲基化DNA 甲基化是指经DNA 甲基转移酶的催化，将S-腺苷甲硫氨酸提供的甲基添加在DNA 分子上。叶酸是一碳单位供体，叶酸缺乏或代谢障碍可导致全基因组低甲基化。国内一项病例研究发现，NTDs 患儿脑组织全基因组甲基化水平显著低于对照组，且MTHFR 为TT 型的NTDs 病例表现出显著的低甲基化[29]。最新研究发现在人类叶酸不足的NTDs 中，印迹基因Mest/Peg1 的甲基化水平降低，同时Mest/Peg1 的mRNA 水平在低叶酸条件下通过低甲基化修饰上调。Mest/Peg1 的上调抑制了Wnt 通路的关键成分Lrp6 基因的表达，从而影响神经系统的发育[30]。还有研究表明，DNA 低甲基化通过微小RNA（miRNA）表达失调参与NTDs 的形成[31]。这些都提示DNA 低甲基化可能是NTDs 发生的危险因素。DNA 低甲基化会减缓或中断组织生长发育，通过影响胚胎DNA 和蛋白质的合成，造成胚胎停育、自然流产及胎儿畸形。DNA 低甲基化，DNA 稳定性降低，DNA 断裂、染色体分离和重组变异，这是造成唐氏综合征的原因。此外，DNA 低甲基化对精子也有重要影响，其可导致精子数量减少，造成男性不育[9]。

4.3 赖氨酸去甲基化酶（KDM6A）KDM6A 位于X 染色体短臂11.3，是H3K27me3 的特异性去甲基化酶，可以催化H3K27me3 去甲基化，促进基因的表达，在胚胎发育过程中起重要调控作用。高军等[32]在动物实验中发现，低叶酸环境中DNA 双链断裂增加，KDM6A 表达减少，导致DNA 双链修复基因KU70/80的表达降低，引起DNA 断裂修复异常，进而导致NTDs的发生。目前相关研究还比较少，这为我们研究叶酸缺乏导致NTDs 的病因研究提供了新思路。

4.4 组蛋白修饰组蛋白修饰是表观遗传调控的重要组成部分，包括甲基化、乙酰化、磷酸化和泛素化等。组蛋白修饰水平与脑组织发育和维持正常神经系统功能密切相关。在胚胎发育过程中组蛋白修饰起重要调节作用。鲁峰刚等[33]在NTDs 鼠中叶酸干预与组蛋白H3K27me3 表达关系的研究中发现，在叶酸缺乏的NTDs 胎鼠中，H3K27me3 表达水平上调，其下游叶酸代谢相关基因Adcy2 表达也上调；通过叶酸干预，可有效降低两者表达，从而降低NTDs的发生率。张勤等[34]研究发现在叶酸缺乏的人胚肾细胞中组蛋白H3K79me1 及H3K79me2 水平低于正常培养组，提示叶酸可影响组蛋白修饰从而参与NTDs 的发生。Pei 等[35]在叶酸缺乏诱导组蛋白H2A泛素化导致NTDs 相关基因表达下调的研究中发现，在叶酸缺乏的情况下，H2AK119ub1 表达增高，下调了小鼠胚胎干细胞中神经管关闭相关基因Cdx2、Nes、Pax6 和Gata4 的表达，从而导致NTDs 的发生。补充叶酸可以恢复H2AK119ub1 与神经管关闭相关基因的结合，恢复正常神经管闭合，从而预防NTDs 的发生。Li 等[36]在一个队列中对神经管关闭基因进行了测序，发现在NTDs 病例中局部脑组织叶酸浓度较低，在神经外胚层细胞中，叶酸不足减弱了Msh6 与组蛋白H3K36me3 的结合，减少了与神经管关闭基因的结合，使错配修复缺乏，进而导致NTDs的发生。这些研究都提示了叶酸缺乏导致组蛋白修饰改变与NTDs 的发病相关。

5 结语与展望

叶酸缺乏及代谢障碍会导致许多不良生育发生，给家庭及社会造成负担，故掌握其发病机制非常重要。我国于2017 年已发布围受孕期增补叶酸预防胎儿NTDs 的指南，明确指出要根据地区、不良生育史、家族史、叶酸代谢酶基因型等的不同做到个性化增补叶酸。尽管目前叶酸与不良生育相关研究较多，但不良生育发病原因复杂，还有许多未知的领域，相信随着分子生物学研究不断进展，能更清楚两者之间的关联，并能够发现血清或羊水中相关分子标记物，为预防及早期发现不良生育提供依据，这将是我们未来研究的方向和目标。