间隙连接蛋白43与胎膜早破的相关性

南连玲，穆碗如，张红，李杰，杨晨晨，汤玲，白玉芳

胎膜早破（premature rupture of membranes，PROM）是指羊膜和绒毛膜在分娩前破裂，是产科最常见的早产原因之一，PROM 发生的危险因素包括感染、双胎妊娠、阴道炎、环境温度过高等[1]。PROM可导致新生儿呼吸窘迫综合征、绒毛膜羊膜炎、胎盘早剥、败血症等，95%的妊娠妇女在破膜后4 d 内分娩，没有发生感染的PROM 患者潜伏期常延长，造成不可避免的早产并给母儿带来严重危害[2-3]。间隙连接通讯是细胞间重要的信息及物质交互形式，间隙连接蛋白43（Connexin43，Cx43）为间隙连接蛋白家族中最常见的一类蛋白，在胎膜中表达并在胎膜完整性维持中有重要作用，探讨Cx43 在PROM 发生中的作用可为PROM 的预防及治疗提供新思路。

1 PROM 结构基础

PROM 患者胎膜破口处胎膜由羊膜和绒毛膜组成，羊膜在解剖学上由一层单层立方上皮细胞组成，其厚度约为100 μm，羊膜中的单个胶原纤维的直径约为50 nm，组织成随机交织且无规律方向性的松散纤维束[4]。绒毛膜由绒毛膜滋养细胞和分散的成纤维细胞组成，其厚度为300～500 μm。绒毛膜中胶原蛋白形成直径为4～6 μm 的较厚的纤维束，绒毛膜柔顺且可扩展，其坚韧度及拉伸度明显高于羊膜[5]。在胎膜结构中，相对薄弱的羊膜在受到压力及炎症刺激时较绒毛膜更易发生破裂，进而导致胎膜破裂[6]。故若羊膜在临产前破裂，则会显著增加PROM 的风险，给母儿带来严重危害。

羊膜上没有血管和神经，一旦受到损伤，很难自行愈合[7]。羊膜自胎儿侧至母体侧分别为羊膜上皮层、基底膜、致密层、成纤维层、纤维细胞层、中间层。羊膜上皮层细胞分泌Ⅲ、Ⅳ型胶原、糖蛋白、层黏连蛋白和纤连蛋白，它们形成与基底膜的连接。致密层由成纤维细胞层分泌的Ⅰ型和Ⅲ型胶原形成，Ⅰ型和Ⅲ型胶原与核心蛋白聚糖的结合在羊膜的机械稳定性及促进胶原纤维侧向排列中起重要作用，该层存在间充质细胞和巨噬细胞，可及时修复胎膜损伤[8]。中间层形成羊膜和绒毛膜之间的连接，由Ⅲ型胶原、蛋白聚糖和糖蛋白组成，在羊膜腔不足以使绒毛膜和羊膜之间的空隙消失前发挥重要作用[9]。

2 PROM 发病机制探讨

胎膜承受压力过大时，胎膜发生超出容受范围的延展扩张，进而羊膜层与绒毛膜层分离，若发生绒毛膜破裂，则拉伸弹性差的羊膜进一步扩张，最终导致羊膜破裂发生PROM[10]。若胎膜存在炎症，则机械压力增加时更易发生PROM[11]。已有研究表明，特定基质蛋白降解酶以及普遍蛋白水解作用对基底膜的降解是导致足月或未足月PROM 的重要相关因素。膜的机械性能通常与结缔组织中胶原蛋白的类型和分布有关。羊膜的机械稳定性是由核心蛋白聚糖决定的，核心蛋白聚糖结合Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白，促进了胶原纤维的侧向排列。Mogami 等[8]的研究表明，如果胶原蛋白含量或纤维交联减少，胎膜的强度会降低，则可能发生PROM。核心蛋白聚糖与纤维胶原蛋白的影响因素均可能使胎膜的拉伸强度及稳定性发生改变，削弱胎膜强度，进而导致PROM 的发生。

覆盖宫颈处的胎膜存在一个薄弱区域，表现出胶原重塑和凋亡增加的特征，该区域在受到压力或创伤后容易发生破裂。对该薄弱区域的研究尚未见报道，若能明确该薄弱区域的形成机制，有望为预防PROM 提供有效手段。Richardson 等[12]通过多光子自发荧光和二次谐波成像（SHG）观察到胎膜对PROM患者胎膜组织进行组织成像，发现了胎膜间的微裂缝，胎膜受损时微裂缝可作为羊水泄漏的通道，机体修补微裂缝失败也可被视为胎膜破裂的原因之一。尚有研究发现，体内激素水平同样可影响胎膜强度，如糖皮质激素可增加羊膜中环氧合酶2（COX-2）的表达，削弱胎膜以诱发PROM[13]。炎症因素是导致PROM 的重要原因之一，Cx43 可调节单核细胞与内皮细胞黏附，影响白细胞参与炎症级联反应，Cx43水平下调后，局部炎症减轻，Cx43 水平升高或可加重局部炎症反应而导致PROM[14-15]。孕激素可减少Cx43 表达进而可能预防因体内炎症因素引起的未足月PROM[10]。由此推测，炎症、胎膜的自我修复能力、妊娠妇女体内激素水平及外在的机械强度增加均可能导致PROM，进而造成早产及一系列母儿并发症。

3 Cx43 与PROM 相关性探讨

PROM 的发病机制复杂，涉及胎膜自身结构、妊娠妇女免疫力及妊娠妇女体内激素水平等。随着对胎膜的研究越来越深入，分子生物学实验技术的应用也发现了很多预测PROM 的指标，对基质金属蛋白酶、间隙连接蛋白、凋亡因子等在PROM 中的研究也越来越多，Cx43 作为细胞间连接、信息及物质交换的重要蛋白，在胎膜的微裂缝进展及胶原紧密排列中发挥重要作用，可能导致或加快PROM 的发生。随着“全面二孩”政策的实施，预防早产及PROM 显得尤为重要，亟需发现高敏感度、高特异度的临床检测指标。

3.1 Cx43 的基本结构Cx43 是最常见的缝隙连接蛋白，长度为43 ku。Cx43 由内质网合成，在反高尔基体内形成六聚体结构，在细胞膜上由6 个亚单位的跨膜蛋白形成半通道结构，其氨基端和羧基端均位于细胞内，2 个胞外环负责与其他细胞膜上的半通道结构进行信息交互及物质交换，1 个胞内环参与细胞通透性的调节。Cx43 蛋白发挥各种作用的核心是由胞质羧基端（CT）的序列和功能决定的，CT 包含多种蛋白结合位点，参与调节细胞黏附功能、细胞骨架、细胞间形成半通道结构等作用[16]。CT 的长度及构成因间隙连接蛋白种类及功能不同而有所不同，而细胞膜上的各类间隙连接蛋白有结构相似的同源结构，故表达不同连接蛋白的相邻细胞也可以形成功能通道，以保证细胞间缝隙连接通讯的正常功能[17]。

3.2 Cx43 与妊娠的发生、发展相关细胞间连接通讯在细胞的增殖、分化及凋亡中均起着重要作用，最重要的成员Cx43 在人体广泛存在[18]。Cx43 在胚胎干细胞分化、受精卵着床和随后的胎儿发育过程中至关重要，Cx43 的表达减少可导致复发性流产的发生[19]。Shin 等[20]在猪卵母细胞复合物的成熟过程中，受精卵、2～4 细胞期、8～16 细胞期和桑葚胚中检测到大量的Cx43 转录物，并发现Cx43 基因敲除可显著降低囊胚发育质量和囊胚内细胞总数，导致胚胎质量下降。Cx43 在卵母细胞的发育和成熟过程中也有不可或缺的作用。Cx43 是卵泡发育的所有阶段中在颗粒细胞中表达最丰富的缝隙连接蛋白，卵丘细胞依赖于缝隙连接为卵母细胞提供少量的营养物质，以支持卵母细胞成熟[21]。Liu 等[22]发现体内雌激素浓度越高，Cx43 基因和蛋白的表达水平越低，可能干扰子宫内膜状态，影响胚胎的正常着床。由此可见，Cx43 在妊娠发生及妊娠初期都有重要作用，目前Cx43 在产科领域研究甚少，若能发现Cx43 在妊娠发生、发展中的具体作用机制，可有望为预防妊娠期疾病及母儿并发症提供有力手段。Cx43 是子宫平滑肌细胞的主要缝隙连接蛋白[23]。Ou 等[24]在大鼠中发现机械拉伸可导致Cx43 水平明显增高，而孕激素的存在会阻断这种增高现象，所以分娩期间子宫肌层中Cx43 表达依赖于低孕酮条件下的子宫肌层拉伸。Cx43 在宫颈中定位于子宫颈间质和肌肉组织，Cx43在宫颈癌组织中低表达，Cx43 过表达可抑制宫颈癌细胞恶性生物学行为[25]。胚胎着床前子宫内膜中Cx43 表达下降利于胚胎着床，Cx43 表达升高可导致体外受精-胚胎移植的失败[26]。

由此可见，Cx43 在胎膜、子宫肌层、子宫颈组织中均有表达，多项研究证明Cx43 表达水平受到内分泌和机械因素相互作用的调节和协调，Cx43 作为细胞间间隙连接通讯的重要因子，广泛参与妊娠的发生、妊娠进展及妇产科疾病，受到体内多种因素影响调节，在生理状态与疾病发生中均有参与，但是其具体作用机制尚不明确，若能明确其在发病机制中的作用，可有效预防疾病发生。

3.3 Cx43 与损伤胎膜修复密切相关在PROM 发生过程中，薄弱的羊膜起着关键作用，若羊膜发生破裂，将会显著增加PROM 的风险。王艳艳等[27]通过免疫组织化学染色PV 法发现Cx43 主要定位于绒毛膜滋养细胞层细胞，羊膜上皮细胞也有少许表达，PROM 患者胎膜中Cx43 水平相比正常产妇降低。Barrett 等[28]建立了受损人工胎膜模型，通过免疫荧光（IMF）共聚焦显微镜及SHG 技术观察到在人工胎膜创伤模型培养168 h 后，Cx43 在胎膜成纤维细胞层表达水平显著增加，在创伤边缘的胎膜微裂缝中表达更高，并发现间质细胞与伤口前缘呈90°极化，驱动胶原蛋白的结构发生变化，从而减慢了胎膜创口处的细胞迁移效率，减慢了创口愈合速度。Barrett等[29]发现靶向Cx43 可以防止应变诱导的细胞外基质损伤，并促进胎膜的组织重塑机制，炎症因素和机械因素的结合可以扰乱胎膜中由Cx43 信号介导的典型的机械转导过程，对拉伸敏感的CX43/蛋白激酶B 信号通路可因炎症介质前列腺素E2和基质金属蛋白酶的增加而激活，进而导致胎膜中胶原降解，增加对促进组织重塑有重要作用的糖胺聚糖的合成，促使胎膜组织结构重塑而导致胎膜正常结构改变。胎儿手术后绒毛膜中Cx43 的过度表达会诱导胶原基质的形态和结构变化，从而可能干扰正常的愈合机制。

3.4 Cx43 与Ⅰ、Ⅲ型胶原密切相关羊膜的强度主要是由Ⅰ、Ⅲ型胶原决定。Cx43 模拟肽Gap27 与Cx43 细胞外环结合，影响Ⅲ型胶原表达；而TATGap19 与细胞质环的L2 结构域结合，改变其与羧基末端尾部的相互作用，影响Ⅰ型胶原表达[30]。Montgomery 等[31]在Cx43 基因局部敲除小鼠皮肤受伤后第7 天发现，Cx43 局部基因被敲除的小鼠Ⅰ、Ⅲ型胶原的基因表达显著增加。Cogliati 等[32]也在Cx43 基因被敲除的小鼠皮肤中发现，Ⅰ、Ⅲ型胶原的mRNA 表达量在皮肤损伤后7 d 达到高峰，且真皮再上皮化和创面闭合、成纤维细胞增殖和活化、细胞外基质重塑速度均明显加快，可证实Cx43 能抑制Ⅰ、Ⅲ型胶原水平。王宁等[18]在皮肤组织中发现Cx43表达水平与Ⅰ型胶原水平呈负相关。胎儿手术后AM 中Cx43 的过度表达会诱导胶原基质的形态和结构变化，从而可能干扰正常的愈合机制[33]。说明Cx43 可能通过干扰Ⅰ、Ⅲ型或更多胶原而参与PROM。目前尚无更多证据证实Cx43 在胎膜中是否对Ⅰ、Ⅲ型胶原有同样影响，尚待进一步研究证实。

4 结语与展望

综上所述，目前关于预测PROM 的生物学标记物很多，但敏感度和特异度有限，尚需进一步探究具有高敏感度、高特异度的标记物。而Cx43 作为间隙连接蛋白家族的重要成员，对检测胎膜间隙连接功能有明确特异性。多项研究已证实，Cx43 在胎膜完整性与重塑过程中发挥重要作用，已有学者通过显微镜技术观察到胎膜的细胞结构，并通过免疫染色方法在胎膜细胞中发现Cx43 的表达，这为通过检测妊娠妇女体内Cx43 水平预测PROM 的提供了理论依据。基于间隙连接通讯在细胞间连接通讯的重要作用，Cx43 或可作为PROM 的预测指标及治疗靶点，改善PROM 患者的母儿预后。然而目前对Cx43参与PROM 的具体机制及表达方式尚不明确，且PROM 病因尚未完全掌握，尚需进一步深入研究。