异丙酚对心肌缺血再灌注损伤大鼠模型Toll样受体4及高迁移率族蛋白1表达的影响

黎真真, 陈飞任, 吴红发, 钟有清

(1.海南省海口市妇幼保健院 麻醉科, 海南 海口, 570102;2.海南医学院第一附属医院 呼吸内科, 海南 海口, 570102)

心肌缺血再灌注损伤(MIRI)是因多种病因导致的心肌缺血坏死，严重者可出现心律失常、心功能障碍等，甚至导致死亡[1]。手术过程中心肌缺血发生率较高，适当应用麻醉剂可发挥心肌保护作用。研究[2-3]发现异丙酚可保护缺血的肝细胞，具有抗氧化功能，可清除MIRI中释放的自由基。MIRI发生涉及多种细胞因子、信号通路，研究[4]表明，抑制氧自由基、炎症因子的释放能显著减轻心肌缺血再灌注引起的细胞凋亡、坏死。高迁移率族蛋白1(HMGB1)是一种炎性因子，在氧化应激等情况下可被释放入血，与相应的配体结合，扩大炎症反应及免疫细胞的迁移、分化等[5]。Toll样受体4(TLR-4)属于跨膜信号转导家族蛋白，在免疫功能维持、炎性反应中起到至关重要的作用[6], TLR-4与炎性反应有关，可能参与了MIRI的发生。本研究拟通过建立大鼠MIRI模型，探讨异丙酚是否对MIRI起保护作用，并研究该过程中HMGB1、TLR4蛋白的表达变化，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选取60只清洁级Wista大鼠，鼠龄18～20周，雌雄不限，体质量340～400 g, 由江苏省农业科学院实验动物中心提供，许可证号为SCXK(苏)2012-0005, 使用许可证号为SYXK(苏)2014-0030。动物处理及实验过程得到海南省人民医院动物关怀及使用委员会的许可(HNRMYY0012)。实验研究过程中严格遵守3R原则。

1.2 主要仪器及试剂

兔抗鼠HMGB1、TLR4及β-actin单克隆抗体，辣根过氧化物酶(HRP)标记的第二抗体(Sigma公司，美国); TRIzol试剂盒(Invitrogen公司，美国); 逆转录、PCR试剂盒(大连宝生物，中国); 蛋白酶K溶液(上海生工技术有限公司，中国); 肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-6(IL-6)引物(上海生工技术有限公司，中国); 异丙酚(批号090822, 河北九派制药有限公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 心肌缺血再灌注大鼠模型的建立及分组: 所有实验动物在动物房进行适应性饲养1周。60只大鼠随机分为4组，即假手术组(A组)、假手术联合异丙酚组(B组)、心肌缺血再灌注组(C组)、心肌缺血再灌注联合异丙酚组(D组)。A组采用常规戊巴比妥钠30 mg/kg耳缘静脉麻醉，消毒、铺巾。行气管插管，连接麻醉机，以混有30%氧气的空氧混合气体作为载体气体，通气流速(mL/min)=0.65×体质量(g)。开胸，显露心脏，于左心耳根部2 mm处穿线后，不夹闭左冠状动脉前降支及心大静脉, 60 min后缝合。B组手术开始前10 min静脉泵入异丙酚6 mg/kg至术后60 min。C组麻醉后于胸骨左缘3～4肋间开胸，显露心脏，于左心耳根部2 mm处用丝线夹闭左冠状动脉前降支及心大静脉，使心肌失去血液灌注，持续缺血30 min后，打开夹闭的动脉，再灌注120 min。D组手术开始前10 min静脉泵入异丙酚 6 mg/kg至术后60 min。

1.3.2 HE染色: 实验完毕后，解剖出心脏，取心肌组织，制备石蜡切片(4 μm), 二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水，切片经蒸馏水洗涤，放入苏木精溶液染色数分钟，经酸水及氨水分色，伊红染色，梯度酒精脱水，二甲苯透明后用树胶封片，显微镜下观察。

1.3.3 TUNEL法检测细胞凋亡率: 心肌标本经石蜡切片预处理，脱蜡、水化、磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤，滴加蛋白酶K溶液100 μL室温下孵育8 min，PBS洗涤; 在此基础上滴加抗荧光素体和TUNEL标志液，而后利用PBS冲洗3次, 5 min/次，经缓冲液Ⅲ平衡后，室温显色，并滴加氮蓝四唑/溴氯吲哚基磷酸盐显色及观察。采用Leica QWin V3电脑图像分析系统，观察TUNEL阳性细胞并计数，计算凋亡细胞数占总细胞数的百分比，得到心肌凋亡指数。

1.3.4 RT-PCR法检测TNF-α和IL-6 mRNA水平: 采用超声粉碎心肌组织细胞并采用PBS洗涤、溶解，然后根据TRIzol试剂盒提示一步法提取心肌细胞中RNA分子，测定RNA浓度和纯度后，采用逆转录试剂盒合成cDNA。目标引物序列参照Gene Bank, 由日本Takara公司合成，见表1。采用PCR扩增仪，根据反应要求配置反应体系，包括SYBR®Premix Ex TaqTM(2×)12.5 μL和上下游引物10 μmol/L各1.0 μL, 加反应水至总体积为25.0 μL。反应参数设置: 95 ℃预退变 5 min, 95 ℃退变 30 s, 56 ℃退火30 s, 72 ℃ 30 s共30个循环, 75 ℃读取荧光，构建溶解曲线。2-△△Ct法计算目标引物mRNA的相对表达量。

表1 目标引物序列和大小

1.3.5 Western Blot检测HMGB1、TLR4蛋白量表达: 解剖出心肌组织，加2 mL RIPA组织裂解液，匀浆，冰浴30 min, 40 ℃ 500×g离心5 min, 吸去上层液体，超声波破核，再次离心，取上层液体10 μL待测。配胶，上样，电泳，转膜，切膜，封闭液封闭1 h, 逐次兔抗鼠HMGB1、TLR4及β-actin单克隆抗体、HRP标记的二抗。Bio-Rad成像仪曝光成像，Image Lab Software测定光密度，结果以目标蛋白与参照蛋白条带比值表示相对表达量。

1.4 统计学方法

2 结 果

2.1 各组大鼠心肌组织病理学变化

在光学显微镜下, A组心肌组织排列整齐，细胞形态正常; B组心肌结构正常，轻度水肿，少量炎症细胞浸润; C组、D组中心肌纤维变形和紊乱，心肌细胞肿胀、破裂以及炎性细胞浸润。见图1。

A: A组心肌组织; B: B组心肌组织; C: C组心肌组织，箭头所指为心肌细胞破裂; D: D组心肌组织。

2.2 各组大鼠心肌细胞凋亡情况比较

TUNEL染色表明，凋亡的心肌细胞呈棕褐色。C组心肌凋亡指数为(0.39±0.05)%, 高于A组的(0.01±0.02)%、B组的(0.01±0.03)%、D组的(0.17±0.03)%, 差异有统计学意义(t=15.36、15.44、9.73,P<0.01)。见图2。

A: A组心肌细胞排列规整，未见凋亡细胞; B: B组心肌细胞核完整，无凋亡细胞;C: C组可见大量凋亡细胞，呈褐色，箭头所指为凋亡细胞; D: D组可见散在的棕褐色心肌细胞，但较C组少，箭头所指为凋亡细胞;E: 各组心肌凋亡指数比较。与A组、B组比较, **P<0.01; 与C组比较, ##P<0.01。

2.3 各组TNF-α和IL-6的mRNA水平比较

A组大鼠心肌TNF-α和IL-6的mRNA表达水平与B组比较，差异无统计学意义(P>0.05); C组、D组大鼠心肌TNF-α、IL-6的mRNA表达水平高于A组，差异有统计学意义(t=16.26、8.04、17.66、11.83,P=0.01、0.02、0.01、0.01); D组大鼠心肌TNF-α、IL-6的mRNA表达水平低于C组，差异有统计学意义(t=9.04、8.55,P=0.03、0.04)。见图3。

A: RT-PCR法检测各组TNF-α mRNA的表达水平; B: RT-PCR法检测各组IL-6 mRNA的表达水平;C: 各组TNF-α mRNA的表达水平比较; D: 各组IL-6 mRNA的表达水平比较。

2.4 各组大鼠心肌组织TLR4、HMGB1蛋白表达

A组大鼠心肌TLR4、HMGB1蛋白表达水平与B组比较，差异无统计学意义(P>0.05); C组、D组大鼠心肌TLR4、HMGB1蛋白表达水平高于A组，差异有统计学意义(t=15.87、9.11、11.95、8.73,P<0.01); D组大鼠心肌TLR4、HMGB1蛋白表达水平低于C组，差异有统计学意义(t=10.02、9.83,P=0.03、0.03)。见图4。

A: Western Blot检测HMGB1、TLR4蛋白量表达; B: 各组HMGB1、TLR4蛋白定量结果比较。

3 讨 论

异丙酚是临床常用的全身麻醉诱导剂，具有起效快、副作用小等优势。研究[7]表明，异丙酚在肝、肾、脑等脏器损伤中可发挥保护作用。研究[8]表明，异丙酚可以保护心血管疾病手术患者的心血管系统。研究[9]表明，异丙酚对MIRI犬的心电传导、心功能、心肌灌注具有保护功能。动物实验[10]结果提示，异丙酚可抑制心肌纤维收缩，从而减少心肌耗能，同时异丙酚具有抗氧化作用，可维持细胞内线粒体完整性。曹军涛等[11]研究结果表明，异丙酚可减轻糖尿病大鼠MIRI导致的心肌细胞受损，保护大鼠心脏功能。本研究心肌组织HE染色结果提示，缺血再灌注的心肌细胞排列紊乱，胞浆染色不均匀，细胞核消失，呈空泡，心肌纤维排列松散、无序，肌纤维变性肿胀，间质水肿，红细胞渗漏，中性粒细胞浸润，A组大鼠心肌正常，同时发现异丙酚预处理的大鼠心肌损伤较未使用异丙酚大鼠轻，TUNEL染色同样表明异丙酚可减轻MIRI导致的心肌损害。

研究[12]表明，炎性反应在MIRI中发挥重要的作用。TNF-α、IL-6是参与MIRI的重要炎性介质。TNF-α为促炎因子，由心肌巨噬细胞和心肌细胞分泌[13]; TNF-α可抑制心肌细胞葡萄糖转运蛋白的表达，导致心肌细胞对葡萄糖的利用障碍。TNF-α还可以诱导IL-1、IL-6等大量合成，并通过一系列的通道，正反馈引起TNF-α的合成，扩大炎症反应[14]。

HMGB1属于核蛋白家族，当细胞出现损伤、坏死或机体在炎性反应的刺激下巨噬细胞释放入血，与免疫细胞膜上的受体结合，引起炎症因子(TNF-α、IL-6)的分泌以及免疫细胞的迁移、分化等[15]。研究[16]表明, MIRI大鼠血清HMGB1含量明显高于正常大鼠，静脉滴注抗HMGB1抗体后可减轻心肌细胞损害。研究[17]提示, HMGB1预处理能减轻心肌MIRI程度，缩小心肌坏死范围。TLR-4属于跨膜信号转导家族蛋白，在免疫功能维持、炎性反应中发挥重要的作用[18], TLR-4可能也参与了HMGB1信号转导。研究[19]表明，使用HMGB1抑制剂后，细胞可通过抑制TLR4/NF-κB通道蛋白减轻坏死性小肠结肠炎的症状。研究[20]提示维达立肽可通过TLR4/NF-κB/HMGB1通路保护缺血再灌注损伤的肝脏。研究[21]认为，HMGB1可结合糖基化终产物受体(RAGE), 进而促进TLR4和炎症因子的分泌，而TLR4又可促进HMGB1分泌。上述结果表明，HMGB1可通过TLR4信号通路促进炎性反应，参与细胞缺血再灌注损伤。

本研究结果表明，MIRI组大鼠心肌的TLR4、HMGB1、TNF-α、IL-6较正常大鼠显著升高，而异丙酚预处理后的大鼠心肌TLR4、HMGB1、TNF-α、IL-6的表达水平显著降低，表明静脉注射异丙酚可保护缺血再灌注损伤的心肌，可能与异丙酚清除细胞产生的氧自由基、抑制HMGB1/TLR4通道的活性、降低炎性介质TNF-α、IL-6的表达以及减轻炎性反应有关。

综上所述，异丙酚能显著减轻MIRI大鼠的心肌细胞凋亡和炎症反应，其机制可能与异丙酚抑制HMGB1、LR4蛋白活性和减少炎性因子的释放有关。