不同施肥模式对植烟棕壤活性有机碳组分和酶活性的影响

王 鹏，郑学博，梁洪波，宋文静，季 璇，徐艳丽，况 帅，董建新

(1.中国农业科学院 烟草研究所，烟草生物学与加工重点实验室，青岛烟草资源与环境野外科学观测试验站，山东 青岛 266101；2.中国农业科学院 研究生院，北京 100081)

无机肥在我国农业生产中对农作物增产的贡献超过50%，我国在全球不到7%的耕地上施用了超过30%的无机肥，无机肥施用量约是世界平均量的4倍多，无机肥用量增加利用率却降低[1]。过量施用无机肥可导致土壤耕层N、P、K等营养元素大量流失[2]；有机碳含量下降，微生物数量和酶活性降低，最终导致土壤肥力整体下降[3]。肥料对烟叶产量的贡献最高可达40%，烟叶生产过程中普遍存在过量施用化肥的现象，烟区农田生态系统养分淋失严重[4]。过量施用化肥可获得单位面积耕地产量最大化，但使土壤结构受损肥力降低，烟叶品质下降，造成了植烟地区严重的农业面源污染[5]。有机肥可通过增加土壤有机碳库，提高微生物数量和酶活性来改良土壤，能够全面提供作物生长所需的营养，是目前应用最有效地降低化肥用量并提升烟叶品质的方式[6]。陆海飞等[7]研究表明，多年施用有机肥可显著增加种植水稻红壤的有机碳含量和β-葡糖糖苷酶(S-β-GC)、纤维素酶(S-CL)、过氧化物酶(S-POD)活性。张长华等[8]研究表明，贵州黄壤有机无机肥配施1 a后土壤肥力改善显著，显著增加了土壤蔗糖酶(S-SC)、过氧化氢酶活性和烟叶品质。季璇等[9]研究表明，在四川植烟紫色土施用菜籽饼肥1 a后，显著增加了有机碳含量，显著降低了多酚氧化酶(S-PPD)和S-POD活性。

有机肥施用后可通过改变土壤有机碳库来间接影响碳转化相关酶的活性。可溶性有机碳(DOC)、微生物量有机碳(MBC)及易氧化有机碳(ROC)是土壤活性有机碳库的重要表征指标[10-11]。de Brito等[12]研究表明，DOC和MBC在土壤中停留时间短，具有不稳定性，对环境变化十分敏感，在不同施肥模式下可反映土壤碳库的动态变化。倪进治等[13]研究表明，不同施肥处理下，DOC/TOC和SME(MBC/TOC)是反映土壤有机碳质量的一个较好指标。土壤碳库管理指数(CPMI)可作为系统和敏感的反应土壤有机碳质量变化的监测指标，是施肥措施引起土壤有机碳变化的重要依据[14]。土壤中有机碳分解与积累、养分元素循环等生物化学反应直接或间接由土壤酶催化提供动力支持[15]。Li等[16]研究表明，土壤中DOC和MBC对S-CL和S-β-GC起显著正影响作用，而S-POD起负影响作用，S-PPD从正负2个方面影响DOC含量。Sinsabaugh等[17]认为纤维素酶可介导土壤有机碳降解、转化；S-PPD和S-POD通过抑制土壤中可溶性酚类物质等的累积，从而抑制水解酶类的活性，减少土壤中有机碳的分解，进而有利于有机碳的固存。李月等[18]研究表明，有机肥施用后能显著增加潮土有机碳含量、S-CL和S-POD活性。马晓霞等[19]研究表明，有机肥施用后能显著升高麦玉轮作黄土地S-CL、S-SC活性和活性有机碳含量。因此，明确土壤活性有机碳组分与碳转化酶活性之间的关系对于准确评估土壤活性炭库的变化具有重要意义。前人的研究因有机肥、土壤和种植作物类型不同导致研究结果不太一致，且对于植烟土壤的研究以短期研究为主；不同施肥模式下对具体碳转化酶活引起有机碳组分变化规律的研究鲜见报道。

棕壤主要分布在胶东半岛及山东中南部丘陵地区，大约占山东耕地面积的29.2%[20]。山东是我国烤烟种植的主要区域之一，常年种植面积在30 000 hm2以上，因此，这一定位试验具有很强的区域代表性[21]。本研究基于10 a的田间定位试验，通过设置不同的施肥模式，结合山东烟区主要的耕种模式“烤烟单作”，旨在明确不同施肥模式下有机碳组分变化的具体规律和碳转化酶活的作用机制，以期为山东烟区植烟棕壤培肥和可持续发展提供基础数据和理论支持。

1 材料和方法

1.1 试验概况

试验位于中国农业科学院青岛烟草资源与环境野外科学观测试验站(36°26′ N，120°34′ E)，地势平坦，海拔75.0 m。年平均气温12.7 ℃，年平均降水量662.1 mm，年平均蒸发量1 612.0 mm，无霜期203 d，属温带季风气候。试验始于2009年，采用烤烟单作的种植模式。土壤类型为棕壤，试验前土壤耕层(0～20 cm)基本理化性质为：pH值 5.56(土∶水=1.0∶2.5)，有机质11.66 g/kg，碱解氮52.69 mg/kg，有效磷10.60 mg/kg，速效钾105.25 mg/kg。

1.2 试验设计

本试验共设置4个处理，每个处理3次重复，随机区组设计，分别为：①不施肥(CK)；②单施化肥(T1)；③化肥有机肥配施(T2)；④单施有机肥(T3)。各小区面积5.0 m×4.4 m = 22.0 m2。供试烤烟品种 NC 89，每年5月中上旬移栽，行距1.1 m，株距0.5 m，各小区栽烟40株。腐熟的牛粪做基肥，化肥分基肥、提苗肥和追肥3次条施：基肥是复合肥435 kg/hm2、硫酸钾225 kg/hm2；提苗肥是移栽时施用的磷酸二铵45 kg/hm2；追肥是移栽后30 d施用的硫酸钾75 kg/hm2和硝酸钾75 kg/hm2。供试肥料类型分别为：复合肥(15-15-15)、硫酸钾(0-0-50)、磷酸二铵(16-40-0)、硝酸钾(13-0-46)和牛粪(含N 11.40 g/kg，P2O510.15 g/kg，K2O 19.55 g/kg，钙25.20 g/kg，镁16.00 g/kg，有机碳201.27 g/kg)。田间管理措施按照当地种植习惯进行。各处理具体施肥量见表1，2。

表1 各试验处理施肥量Tab.1 Application rates of each treatment

表2 各试验处理无机肥的施肥量Tab.2 Inorganic fertilizer application rates of fertilizer in each treatment kg/hm2

1.3 样品采集与分析

于2018，2019年烤烟收获后，用五点取样法采集0～20 cm的土壤，混匀后四分法保存：一部分土壤样品 4 ℃保存，用于测定土壤DOC和MBC等指标；另一部分风干后过0.15 mm筛，用于测定TOC、ROC和碳转化酶活性等指标。

TOC采用HT1300 分析仪(Jena Analytik，德国)测定；ROC采用333 mmol/L-KMnO4氧化法测定[22]；DOC采用K2SO4-Multi C/N 3100分析仪(Jena Analytik，德国)测定；MBC采用氯仿熏蒸-硫酸钾浸提法测定[23-24]。

土壤碳转化酶活(纤维素酶、蔗糖酶、β-葡萄糖苷酶、多酚氧化酶和过氧化物酶)采用上海优选生物技术有限公司提供的试剂盒进行测定。

1.4 数据计算与分析

1.4.1 碳库管理指数的计算 本研究以撂荒地(2019年)为对照进行土壤碳库管理指数的计算[25]：

碳库指数(CPI)=样品有机碳含量(g/kg)/参考土壤有机碳含量(g/kg)；碳库活度(A)= 活性有机碳含量(mg/kg)/非活性有机碳含量(mg/kg)；碳库活度指数(AI)=样品碳库活度(A)/参考土壤碳库活度(A0)；基于以上参数可以得出土壤碳库管理指数(CPMI，%)[26-27]：CPMI=碳库指数(CPI)×碳库活度指数(Al)×100；土壤微生物熵(SME，%)=微生物量有机碳(mg/kg)/总有机碳(mg/kg)。

1.4.2 几何平均酶活性的计算 几何平均酶活性(GMEA)是综合评价土壤生物质量的指标之一[28]：

GMEA=(S-CL×S-SC×S-β-GC×S-PPD×S-POD)1/5

式中：S-CL为纤维素酶；S-SC为蔗糖酶；S-β-GC为β-葡萄糖苷酶；S-PPD为多酚氧化酶；S-POD为过氧化物酶。

1.4.3 数据分析 采用Excel 2019处理试验所有数据，SAS 9.1进行单因素随机区组方差分析、相关性分析、回归分析、通径分析和主成分分析，差异显著性分析采用Duncan多重比较方法，采用Origin 2018进行绘图。

2 结果与分析

2.1 不同施肥模式对土壤活性有机碳组分及CPMI的影响

不同施肥模式对有机碳组分和CPMI的影响见表3，4。随着施肥年限的增加，与CK、T1处理相比，T2、T3处理显著增加了TOC、ROC、DOC、MBC含量和CPMI(P<0.05)；T2较CK、T1、T3显著增加了土壤的DOC/TOC、SME(P<0.05)，这表明有机肥施用对植烟棕壤有明显的培肥作用，土壤性能向良性状态发展。

表3 不同施肥模式对土壤CPMI的影响Tab.3 Effects of different fertilization regimes on soil CPMI

表4 不同施肥模式对土壤DOC及MBC的影响Tab.4 Effects of different fertilization regimes on soil DOC and MBC

2.2 不同施肥模式对碳转化酶活性的影响

不同施肥模式对酶活和酶活性指数的影响见表5。T2、T3较CK、T1处理均显著增加了5种碳转化酶活性(P<0.05)；几何平均酶活性表现为CK

表5 不同施肥模式对土壤酶活性和酶活性指数的影响Tab.5 Effects of different fertilization regimes on soil enzyme activities and index of enzyme activity

2.3 酶活性和有机碳组分的通径分析

酶活性与有机碳组分的相关性分析见表6，逐步回归分析见表7，通径分析见表8。5种酶活性与有机碳组分存在极显著的正相关关系(P<0.01)。逐步回归分析表明，5种碳转化酶对活性有机碳组分的影响程度不同，其中纤维素酶、β-葡萄糖苷酶和多酚氧化酶极显著影响ROC，纤维素酶、蔗糖酶和β-葡萄糖苷酶极显著影响DOC，蔗糖酶和β-葡萄糖苷酶极显著影响MBC(P<0.01)。通径分析表明，β-葡萄糖苷酶对ROC、DOC和MBC表现出较大的直接正效应(1.253，1.499，2.014)；过氧化物酶、蔗糖酶和多酚氧化酶对ROC表现出较大的间接正效应(1.678，1.611，1.511)，过氧化物酶、多酚氧化酶和纤维素酶对DOC表现出较大的间接正效应(2.287，2.100，1.979)，过氧化物酶、多酚氧化酶和纤维素酶对MBC表现出较大的间接正效应(2.483，2.464，2.102)。综上可知，对活性有机碳组分起直接正效应的是纤维素酶、蔗糖酶、β-葡萄糖苷酶，而起间接正效应的是多酚氧化酶、过氧化物酶。

表6 酶活与有机碳组分的相关性(Pearson双侧显著检验)Tab.6 Correlation between enzyme activities and organic carbon components (Pearson 2-tailed test of significance)

表7 酶活与有机碳组分的逐步回归分析Tab.7 Stepwise regression analysis between enzyme activities and organic carbon components

表8 酶活与有机碳组分的通径分析Tab.8 Path analysis between enzyme activities and organic carbon components

2.4 土壤活性有机碳组分和碳转化酶活性的PCA分析

不同施肥模式土壤活性有机碳组分和碳转化酶活性的PCA分析见图1，主成分综合得分见图2。结果表明，第一、二主成分共解释了总变异的98.1%。各处理在PC1上存在明显的空间差异，不同的施肥处理可明显分为2簇：CK、T1为一簇，T2、T3为一簇；而在PC2上则没有显著的空间差异。T2、T3在PC1的正半轴，CK、T1则在负半轴：表明有机肥处理使土壤活性有机碳组分和碳转化酶活性发生显著变化，在PC1上各处理主成分分析表现为T3>T2>T1>CK。结合主成分分析综合得分，不同施肥模式对土壤活性有机碳组分和酶活性影响的顺序为T3>T2>T1>CK，这与之前不同施肥对有机碳组分和碳转化酶活性的研究结果一致。

不同施肥处理活性有机碳组分和碳转化酶活性在第一、二主成分上的载荷值见表9。原始变量与各主成分间的相关系数可用载荷值表征，载荷值越大，表明该原始变量是该主成分的主要影响因子。第一主成分的各分量之间大小大致相当，说明第一主成分是一个综合指标；第二主成分在DOC、S-CL、S-SC、S-β-BC有较大系数，说明第二主成分主要和DOC、S-CL、S-SC、S-β-BC有关。

表9 不同施肥措施有机碳组分和酶活性在第一、二主成分上的载荷值Tab.9 The loaded value of organic carbon components and soil enzyme activities in different fertilization treatments on primary，secondary，respectively(PC1，PC2)

3 结论与讨论

本研究结果表明，无机肥处理可增加土壤中的TOC、ROC及CPMI，这与张玉军等[29]研究结果一致，原因可能是化肥的施用促进烟草根系和植株的生长，导致更多的烟草根系残留物留在土壤中，分解后增加了土壤的活性有机碳含量。皇甫呈惠等[30]研究表明，增施有机肥可以显著增加华北潮土的ROC、DOC、POC；张迪等[31]研究结果表明，增施有机肥可以显著增加水稻土DOC、MBC、ROC及CPMI；本研究结果表明，单施和配施有机肥处理显著增加了土壤活性有机碳组分及CPMI，原因可能是有机肥分解后为土壤提供了大量直接有机碳源；有机肥提高了土壤中碳转化酶和微生物的数量和活度，促进有机碳库的周转[32]。DOC/TOC和SME可以表示土壤的健康状态，比DOC和MBC更能有效反映土壤质量的变化，单施和配施有机肥可显著增加土壤的DOC/TOC和SME，有机肥可直接增加土壤中的有机碳源，在微生物分解作用下释放出更多的DOC和MBC[33]。单施无机肥降低了土壤的DOC/TOC和SME，原因可能是无机肥虽然促进了烟草植株生长，但根系分泌物、凋落物等和有机肥的直接输入碳源相比毕竟有限，根基微生物的大量活动消耗碳源，并且DOC和MBC含量较低且易被转化[34]；无机肥的大量施用导致土壤酸化，虽然SOC增加但不能被微生物分解利用[35]，所以DOC、MBC含量增加不显著。

土壤酶是具有生物催化能力特殊蛋白质的总称，可作为判断土壤生物化学过程强度及评价土壤肥力指标[36]。Borase等[37]研究表明，施用有机肥可以增加有机碳和微生物量碳含量和β-葡萄糖苷酶活性。田小明等[38]研究表明，增施有机肥可以显著增加潮土、灰漠土多酚氧化酶活性，且多酚氧化酶活性与有机肥施用量呈正比。本研究结果表明，单施和配施有机肥处理可显著增加土壤中的多酚氧化酶、过氧化物酶活性，这与季璇等[9]研究结果不一致，可能与不同的有机物料在土壤中的腐殖质化进程有差异，提供的底物浓度不同。土壤酶活性不仅受环境条件(如温度、湿度等)的影响，而且与所处的底物浓度呈正相关关系，有机肥施用量的增加能够为相应的碳转化酶提供更多的酚类、木质素类底物，从而导致2种酶活性的显著增加[39]。但是Grandy等[40]研究表明，碳转化酶与底物浓度间不总是存在显著的相关性，酶动力学随着土壤有机碳的分解过程的变化而波动。本研究结果也表明，单施和配施有机肥处理可显著增加土壤中的纤维素酶、蔗糖酶和β-葡萄糖苷酶活性，这与魏俊杰等[41]研究结果一致。蔗糖酶主要催化分解蔗糖形成葡萄糖和果糖，纤维素酶和β-葡萄糖苷酶主要催化分解纤维素类物质为易溶于水的葡萄糖[42]。纤维素酶、蔗糖酶和β-葡萄糖苷酶活性的增加：一方面是由于有机肥施用量的增加能够为纤维素酶、蔗糖酶和β-葡萄糖苷酶提供更多的二糖和纤维类物质，使底物浓度的增加所引起的[39]；另一方面，多酚氧化酶活性的增加可以将更多的酚类或多酚类物质转化为对应的醌类，从而更大程度的消除土壤酚类物质对纤维素酶、蔗糖酶和β-葡萄糖苷酶这3种水解酶的毒害作用，提高3种酶的活性[40]。

土壤酶参与土壤中各种生物化学过程，如动植残体分解转化、腐殖质的分解与合成，与土壤活性有机碳的形成、转化等密切相关；土壤酶活性可以大致反映某一种土壤生态状况下生物化学过程的相对强度[43]。柳开楼等[44]研究表明，纤维素酶和蔗糖酶是驱动土壤养分迁移和周转的关键因子。蔗糖酶、纤维素酶和β-葡萄糖苷酶均为水解酶，外源输入的有机物质为其提供充足的木质纤维素和蔗糖等物质，将其转化为活性有机碳组分[45]。本研究结果表明，活性有机碳组分和碳转化酶活之间存在极显著的正相关关系(P< 0.01)，碳转化酶活性对活性有机碳组分的影响程度不同，与李增强等[39]研究结果一致，这可能与不同碳转化酶在活性有机碳形成过程中所起的功能不同。多酚氧化酶、过氧化物酶催化土壤中的芳香族化合物氧化成醌类物质，醌类物质与蛋白质、糖类等反应生成色素或者复杂的有机物质，完成土壤芳香族化合物的循环，能够有效减少有机物质的消耗，有利于活性有机碳在土壤中保留，从而间接影响土壤中的活性有机碳含量[46]。本结果表明，有机肥处理对活性有机碳组分和酶活性的影响大于无机肥和不施肥，这说明有机肥可以增加活性有机碳组分和碳转化酶活性，但影响的具体机制还需进一步研究。

综上所述，单施或配施有机肥可增加植烟棕壤活性有机碳组分、碳库管理指数以及碳转化酶活性，碳转化酶活可间接或直接影响活性有机碳组分。DOC、MBC和ROC均与5种碳转化酶之间呈极显著正相关，其中纤维素酶、蔗糖酶和和β-葡萄糖苷酶起直接作用，而多酚氧化酶和过氧化物酶则主要起间接作用。各施肥处理对活性有机碳组分和碳转化酶活性的综合影响可分为2组：不施肥和单施化肥为1组，配施和单施有机肥为1组，其中单施有机肥影响效果最显著。因此，单施或配施有机肥是提升植烟棕壤活性有机碳组分和碳转化酶活性的有效施肥模式，其中单施有机肥培肥效果最显著。