秸秆添加量对土壤生物固氮速率和固氮菌群落特征的影响

李旭，董炜灵，宋阿琳，李艳玲，卢玉秋，王恩召，刘雄舵，王萌，范分良

秸秆添加量对土壤生物固氮速率和固氮菌群落特征的影响

李旭，董炜灵，宋阿琳，李艳玲，卢玉秋，王恩召，刘雄舵，王萌，范分良

中国农业科学院农业资源与农业区划研究所/农业农村部植物营养与肥料重点实验室，北京 100081

【】研究不同秸秆添加量对土壤固氮速率及固氮菌群落结构的影响，为我国秸秆还田及化肥减施增效提供支持。采用室内培养试验，除对照（C0: 0）外共设5个秸秆添加梯度（C1：0.2mg·g-1；C2：1.0mg·g-1；C3：2.0mg·g-1；C4：4.0mg·g-1；C5：10.0mg·g-1），采用15N2标记的方法，在黑暗条件下培养28d后收集土壤样品，进而对生物固氮速率进行定量，利用Illumina PE250高通量测序和荧光定量PCR技术分析固氮功能基因的丰度及群落特征。随着秸秆添加量的增加，土壤硝态氮含量显著下降，铵态氮含量无显著变化，土壤pH有下降趋势。同时，生物固氮速率显著增加，C3、C4及C5处理在培养期间（28d）潜在固氮速率为87—96kgN·hm-2·a-1，相比于对照提高了38.1%—52.4%。各处理固氮微生物基因拷贝数变化范围为5.48×107—9.20×107copies/（g soil），其中，相比于C0，C4及C5处理固氮微生物基因拷贝数均显著提高（＜0.05）。随着秸秆添加量的增加，C4、C5水平的香农-威尔指数显著低于其他4个处理（＜0.05），其他4个处理多样性无显著差异。主成分分析（PCoA）结果显示土壤固氮微生物群落结构主要因秸秆添加量差异而聚集为不同组别。固氮微生物在门水平上分为变形杆菌（Proteobacteria），蓝细菌（Cyanobacteria），厚壁菌（Firmicutes）和放线菌（Actinobacteria）和螺旋体菌（Spirochaetes）。随着秸秆添加量的增加，蓝细菌相对丰度有先增加再降低的趋势；在属水平上，不同优势菌属对秸秆添加量的响应存在明显差异，慢生根瘤菌（）为数量最丰富菌属，随着秸秆添加量的增加，C5相较于C0、C1、C2、C3水平相对丰度差异显著（＜0.05），显著增加了12.07%—14.13%。与生物固氮速率呈正相关的贺氏伪枝藻属（）随着秸秆添加量的增加其相对丰度逐渐增加，但当秸秆添加量达C5水平其相对丰度反而降低（＜0.05）。同时，最小偏二乘路径分析（PLS-PM），冗余分析(RDA)及相关性分析表明生物固氮速率和土壤固氮微生物群落受秸秆添加量和NO3--N含量影响较大。土壤生物固氮速率随着秸秆添加量的增加而增加，秸秆对固氮的促进作用主要源于秸秆添加降低了土壤NO3--N含量，进而促进慢生根瘤菌（）、贺氏伪枝藻属（）和固氮螺菌属（）等固氮菌属微生物的生长。根据本试验结果计算，相比于不添加秸秆，添加秸秆4.0mg·g-1后，土壤生物固氮速率约增加26kg N·hm-2·a-1，可显著降低我国氮肥需求。

固氮微生物；秸秆还田；固氮速率；15N2定量；

0 引言

【研究意义】生物固氮通过少数固氮原核微生物体内的固氮酶系统，将大气中的N2催化转化为植物可利用的形式，每年可为农田生态系统提供氮素输入40—70 Tg N，是农业生态系统中氮素的重要来源之一[1-4]。生物固氮分为共生固氮和非共生固氮。据报道，作物生物量中约有24%的氮素来自非共生固氮[5-6]。近年来，过度施用氮肥导致的一系列环境问题和不断增加的经济成本都要求我们尽可能提高生物固氮的潜力[7-9]。秸秆还田后可补充大量有机碳源和能量，改善土壤理化性质并提高土壤细菌和非共生固氮微生物的数量和活性[10-11]，从而促进生物固氮[12-13]。因此，充分利用秸秆资源，发挥非共生固氮微生物的固氮潜力对农田生态系统氮素输入及农业生产具有重要意义。【前人研究进展】非共生固氮微生物的群落组成及其固氮酶活性受到土壤水分和温度，土壤质地及pH，微量元素，养分有效性（N、P）和碳源可利用性等多种土壤和环境因子的综合影响[14-18]。由这些因素引起的固氮微生物群落多样性及结构的变化，可较好地反应其生物固氮的能力[15,19-20]。一些研究表明土壤中固氮酶活性与可利用的植物残茬量和分解率成正相关[21-23]，作物秸秆还田后可以改变固氮群落结构的组成，增加基因丰度并促进生物固氮[14,20,24-27]，但在一些研究中这种关系还不明确[28-29]。此外，有研究发现固氮速率显示出对固氮微生物多样性增加的饱和趋势[15]。有研究表明，在作物秸秆投入的情况下，非共生固氮微生物的固氮潜力可在2—4周的短时间内达到1—12 kg N·hm-2[21,30]；另一项测量澳大利亚非共生固氮潜力的研究表明，非共生固氮对作物生长的贡献可能小于10 kg N·hm-2·a-1，但在土壤氮含量较低且碳源充足的情况下，固氮效率可能会更高，在理想（温暖，潮湿）条件下新鲜秸秆投入，或可使固氮潜力高达30—38 kg N·hm-2·a-1[11,31]。目前关于秸秆投入对非共生固氮影响的研究说法不一，可能是由两方面原因造成：秸秆还田量不同，已有的研究秸秆还田多为全量添加或非限制性的[11-21]，例如Roper在早期田间试验中，秸秆还田量为4.5 t·hm-2，测得固氮速率约为1.1 kg N·hm-2·a-1，关于不同秸秆添加量与固氮微生物固氮速率的定量研究少之又少；关于非共生固氮微生物的固氮能力的研究，绝大多研究采用乙炔还原法（ARA）间接测定，但可能会造成固氮速率的错误估计，由于测定条件的影响，乙炔还原法（ARA）中C2H2﹕N2的比值可能明显偏离理论转换因子，须使用15N2方法对其进行校正[32]，15N2方法作为定量生物固氮潜力的唯一直接方法，有着良好的灵敏度和精确度[33]。以往的研究表明，变形杆菌（Proteobacteria）和蓝细菌（Cyanobacteria）是土壤中丰富的固氮微生物[34]；同时参与分解玉米秸秆和固氮过程的包括根瘤菌（）、中华根瘤菌（）及部分未培养的固氮微生物[35]。受限于多数固氮菌难以培养及早期克隆测序不能全面了解固氮菌群落特征，秸秆投入如何影响固氮菌群落特征仍需进一步探索。【本研究切入点】上述研究表明，土壤固氮微生物对秸秆投入数量的响应有差异，同时测定方法也存在局限。近年来，随着我国“减肥增效”政策的推进，秸秆还田引起人们的广泛关注，在促进生物固氮能力方面，我们对于秸秆还田后如何影响固氮微生物群落及其固氮酶活性仍缺乏清晰地认识，同时由于多数固氮微生物难以培养，使用15N2同化方法，高通量测序等方法对秸秆还田促进生物固氮能力进行研究势在必行。【拟解决的关键问题】采用15N2方法，揭示秸秆添加量与土壤固氮速率和固氮菌群落特征的关系，以期为秸秆还田促进农业生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验设计

供试土样取样自河南省洛阳市孟津县旱地耕层土（0—20 cm）（北纬N34°52′55.74″，东经E112.24′14.98″），土壤类型为潮土，其基础理化性质为：土壤pH为6.89，土壤有机质36.95 g·kg-1，铵态氮含量8.80 mg·kg-1，硝态氮含量11.00 mg·kg-1，速效磷28.47 mg·kg-1，有效钾210 mg·kg-1，土壤过2 mm筛，去除植物残根和石块等杂质，混匀备用。

土壤预培养（25℃，黑暗条件）7 d后，准确称取5.0 g干土等重的鲜土于20 mL灭菌螺口玻璃瓶中，除对照（C0：0）外分别添加粉碎玉米秸秆（C1：0.2 mg·g-1；C2：1.0 mg·g-1；C3：2.0 mg·g-1；C4：4.0 mg·g-1；C5：10.0 mg·g-1），混合均匀后，加入1.20 mL无菌水平衡水分至60%田间持水量，随后加橡胶塞用铝盖旋紧并检查气密性。15N2处理使用真空泵将玻璃瓶抽成真空，用纯O2反复置换3次以保证瓶中不含N2，随后瓶内气体被置换为15N2﹕O2（v/v= 4﹕1），每7天按照上述方法重新置换气体，为避免可能的污染和对固氮速率的高估[36]，15N2气体使用前均采用OHYAMA等[37]的方法进行清洗后使用。采用实验室空气作为对照，每7天敞口曝气30 min，所有处理黑暗条件下25℃培养28 d。

1.2 样品采集及指标测定

在培养第28天对样品进行破坏性取样，土壤取出后混合均匀，一部分4℃保存，用于理化性质及固氮速率测定，待测完无机氮后，风干磨细用于其他土壤理化指标的测定，其中NO3--N和NH4+-N使用0.01mol·L-1CaCl2浸提，后续比色测定；土壤速效磷用0.5 mol·L-1NaHCO3浸提，钼锑抗比色法测定；土壤速效钾用1mol·L-1醋酸铵浸提，原子吸收仪测定；土壤pH用快速pH测定仪测定；土壤有机质采用K2Cr2O7氧化外加热法；称取少量15N2处理土壤，置于烘箱70℃烘干72 h，随后研磨过100目筛后送样，使用元素分析仪串联同位素质谱仪（IsoPrime100）测定土壤样品中的15N丰度。然后，通过比较15N2处理的土壤相对于对照原子丰度的差异，计算生物固氮（biological N2fixation），计算公式如下：

BNF（μg·g-1DW）= total Nsample（μg·g-1DW）×atom%15Nexcess

式中，BNF（μg·g-1DW）为生物固氮量；atom%15Nexcess=atom%15Nsample-atom%15Ncontrol；total Nsample为总氮含量。另一部分存于-80℃，用于土壤DNA提取。

1.3 DNA提取、PCR扩增和测序

使用FastDNA SPIN Kit for Soil 试剂盒（MP Biomedicals，USA）提取土壤总DNA，随后使用1%琼脂糖凝胶电泳检验DNA提取质量，用NanoDrop 2000微量分光光度计（Thermo Scientific，USA）检测其浓度和纯度，保存至-20℃备用。

将提取的DNA原液稀释至约10 ng·μL-1作为PCR扩增模板，采用two-step PCR法进行扩增。第一轮扩增引物为带有16 bp头部序列的polF（TGC GAY CCS AAR GCB GAC TC），polR（ATS GCC ATC ATY TCR CCG GA），扩增体系为25 μL，包含：2.5 μL 10×buffer，2 μL dNTP，0.25 μL rTaq（Takara）、10 μmol·L-1的前后引物各1 μL、1 μL模板DNA和17.25 μL ddH2O，每个样品3个重复。第一轮PCR扩增程序：95℃预变性3 min后，95℃变性30 s，62℃退火30 s，72℃延伸60 s，循环40次，循环结束后72℃保持10 min，4℃条件下结束。将同一样本的3次重复的DNA扩增混匀后，用1%的琼脂糖凝胶电泳检测。第二轮扩增使用第一轮扩增产物作为模板DNA，前引物为长度为16 bp的不同barcode引物，后引物为polR（ATS GCC ATC ATY TCR CCG GA），扩增体系为50 μL，包括：5 μL 10×buffer，4 μL dNTP，0.5 μL rTaq（Takara）、10 μmol·L-1的前后引物各2 μL、2 μL模板DNA和34.5 μL ddH2O，每个样品3次重复，扩增程序循环次数为10次，其他设定同第一轮。扩增引物及策略参照GABY等[38-39]的方法。

将同一样本的3次重复的DNA扩增混匀后，用1%的琼脂糖凝胶电泳检测。使用PicoGreen试剂盒测定所得PCR产物浓度，等摩尔量混匀后，采用DNA纯化试剂盒（TIANGEN Biotech，Beijing，China）进行纯化回收，按照每个样本的测序量要求，进行相应比例的混合。混合后的样品通过Illumina Hiseq2500 PE250平台（Novogene公司）进行序列测定，测序数据已上传至GSA数据库（GSA编号：CRA002883）。

1.4 绝对定量PCR（qPCR）

qPCR采用ABI 7900实时定量PCR系统进行检测，选用的荧光试剂是SYBR Premix Ex TaqTMⅡ。qPCR的标准曲线制作方法如下：以对照组土样提取DNA为模板进行PCR扩增，扩增引物是ploF（TGC GAY CCS AAR GCB GAC TC）和polR（ATS GCC ATC ATY TCR CCG GA），体系如上所述，检查PCR产物并使用DNA纯化试剂盒（TIANGEN Biotech，Beijing，China）纯化回收产物；使用pMDTM18-T Vector Cloning Kit（TaKaRa Bio Inc.）试剂盒将回收纯化后的PCR产物与pMD18载体连接；最后使用MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.4.0（TaKaRa Bio Inc.）质粒纯化试剂盒对菌液进行质粒提取与纯化，使用NanoDrop 2000微量分光光度计（Thermo Scientific，USA）检测其浓度和纯度，计算质粒拷贝数并逐步稀释到108—101拷贝数备用[40-41]。qPCR扩增引物是ploF（TGC GAY CCS AAR GCB GAC TC）和polR（ATS GCC ATC ATY TCR CCG GA），扩增体系为15 μL，包含7.5 μL 2×SYBR Premix Ex Taq II、0.3 μL 50×ROX Reference Dye、10 μmol·L-1的前后引物各0.6 μL、2 μL DNA模板和4.0 μL ddH2O，每个样品3次重复。扩增程序：95℃预变性30 s，95℃解链5 s，62℃退火30 s，72℃延伸60 s，83℃采集信号10 s，40个循环。

1.5 生物信息学分析

高通量测序数据经过数据质控，进行序列拼接、过滤并去除嵌合体后得到高质量序列。随后以97%相似性水平进行分类操作单元（OTU）聚类，使用数据库进行物种分类注释及后续分析[42]。

1.6 数据处理

试验数据采用Excel 2010和SPSS 21软件进行统计分析，利用ANOVA进行单因素方差分析，利用Duncan法进行多重比较（＜0.05）。土壤理化性质与固氮群落指标及其功能菌属spearman相关关系采用R中的“psych”包分析；群落结构差异及环境因子对群落结构影响的主坐标（PCoA）和冗余分析（RDA）由R中的“vegan”包完成；偏最小二乘路径分析建模（PLS-PM）由R中的“plspm”分析完成。作图软件为Microsoft Excel及R中“pheatmap”及“ggplot2”包。

2 结果

2.1 不同秸秆添加量对土壤理化性质及生物固氮的影响

由表1可知，秸秆添加培养后，随着秸秆添加量增加，土壤pH及NO3--N含量均呈下降趋势，与C0相比，土壤NO3--N含量显著下降，土壤的NH4+-N含量各处理之间无显著差异。利用15N2同化方法对固氮速率定量以衡量固氮酶活性，不同秸秆添加量处理的固氮微生物的固氮速率，相比于不添加秸秆处理（C0），处理C2、C3、C4及C5土壤潜在固氮能力显著增加（＜0.005）。随着秸秆添加量的增加，C3、C4及C5处理之间固氮速率无显著性差异，在培养期间（28 d）潜在生物固氮可达到2.71—3.05 μg N·g-1DW，约为0.10—0.11 mg N·kg-1DW·d-1，相比C0固氮速率提高了35.5%—52.5%。

表1 不同处理的土壤理化性质及生物固氮

表格中数据均为平均值±标准误，n=4；同一列不同字母表示处理之间差异显著（＜0.05）

Data are means±SE, n=4; Means with no letter in common are significantly different among treatments at＜0.05 level; 秸秆添加量Straw addition C0: 0, C1: 0.2 mg·g-1, C2: 1.0 mg·g-1, C3: 2.0 mg·g-1, C4: 4.0 mg·g-1, C5: 10.0 mg·g-1

2.2 固氮微生物群落多样性及群落组成

图1-A为基于97%相似度的OTU数据，采用加权（Weighted Unifrac）算法分别对不同秸秆添加量的微生物群落结构的主成分分析结果。其中，第一主成分和第二主成分的方差贡献率分别为10.97%和8.96%，累计方差贡献率为19.93%；在第一轴上，C0、C1与C4、C5在第一轴上能够很好地分开，解释量为10.97%。

图1-B为15N2处理对应不同秸秆添加量土壤中的固氮微生物基因拷贝数，各处理固氮微生物基因拷贝数为5.48×107—9.20×107copies/(g soil)。其中，相比于C0，C4及C5处理固氮微生物基因拷贝数均显著提高，显著提高了固氮微生物数量和活性（＜0.05）。当秸秆添加量达到4.0 mg·g-1后，再增加秸秆添加量对土壤固氮微生物基因拷贝数无显著影响。图1-C为固氮微生物群落结构香农-威尔指数多样性分析结果，香农-威尔指数越高，微生物群落多样性越丰富，反之亦然。其中，C4、C5水平的香农-威尔指数显著低于其他4个处理（＜0.05），其他4个处理多样性无显著差异。

图1-D为不同秸秆添加量下门水平下固氮微生物群落结构相对丰度，不同处理固氮微生物群落组成主要为变形杆菌（Proteobacteria）、蓝细菌（Cyanobacteria）、厚壁菌（Firmicutes）、放线菌（Actinobacteria）和螺旋体细菌（Spirochaetes）。随着秸秆添加量的增加，C2、C3、C4和C5相比C0水平蓝细菌的相对丰度显著增加（＜0.05），但当秸秆添加量达到10.0mg·g-1时，其相对丰度反而有所降低。对于变形杆菌，C3和C4水平相较于C0、C1、C5水平其相对丰度显著减少（＜0.05）。对于厚壁菌，C4相较于C0、C1、C2水平的相对丰度下降极为显著（＜0.01），C5水平相对于C0、C1、C2和C3水平其相对丰度下降极为显著（＜0.01）。对于放线菌，C5相较于C0、C1、C2和C3水平显著减少（＜0.05）。对于螺旋体门细菌，C2、C3、C4和C5相较于C0水平下相对丰度显著增加（＜0.05）。

图1-E为属水平下不同秸秆添加量下固氮微生物群落结构相对丰度，包含22个优势功能菌属（相对丰度大于1%），其中包括多种α-型、β-型、γ-型变形菌（Proteobacteria），以及一种蓝细菌，如贺氏伪枝藻属（）。慢生根瘤菌（）为最丰富菌属，随着秸秆添加量的增加，C5相较于C0、C1、C2、C3水平相对丰度差异显著（＜0.05），显著增加了12.07%—14.13%。贺氏伪枝藻属（）随着秸秆添加量的增加其相对丰度逐渐增加，但当秸秆添加量达C5水平其相对丰度反而降低（＜0.05）。属和属的相对丰度随着秸秆添加量逐渐增加，但当秸秆添加量达C4和C5水平其相对丰度相较于C3反而显著降低（＜0.05）。随着秸秆添加量增加，相对丰度成增加趋势的属有sp.和属。此外，中华根瘤菌（）和固氮螺菌（），在秸秆添加水平达到C5水平其相对丰度才显著增加（＜0.05）。随着秸秆添加量的增加，相对丰度呈下降趋势的属有弧菌属（）、硫红螺旋菌属（）、弗兰克菌属（）、太阳杆菌属（）及属。

不同字母表示不同秸秆添加量处理差异达到显著水平（P＜0.05），*表示P＜0.05

2.3 相关性分析

表2为环境因子与土壤固氮微生物群落的Spearman相关性分析。相关性分析表明，基因拷贝数与秸秆添加量（=0.708，＜0.005）呈显著正相关，但与pH（=-0.623，＜0.005）和NO3--N含量（=-0.737，＜0.005）呈显著负相关，其中，NO3--N含量与基因拷贝数相关性最强。固氮速率与秸秆添加（= 0.804，＜0.005）和TN（=0.598，＜0.005）呈显著正相关，与NO3--N含量（=-0.828，＜0.005）呈显著负相关，其中，NO3--N含量与固氮速率相关性最强。

图2-A为群落组成结构同环境因子的冗余分析（RDA）结果表明，所检测的环境因子对土壤固氮微生物群落结构差异解释量为35.54%，RDA1和RDA2解释量分别为28.38%和3.67%，生物固氮量（BNF）及土壤环境因子中的NO3--N含量和pH的影响作用达到显著。如图2-B所示，使用PLS-PM方法来研究不同秸秆添加量（straw addition）、培养后土壤pH及有效氮浓度（NO3-、NH4+）、基因丰度（），固氮微生物群落结构（communitystructure PCoA）和生物固氮（BNF）之间的关系。其中，路径系数表示变量之间线性关系（直接效应）的方向和强度，间接效应为预测变量和响应变量之间路径系数相乘，潜在变量之间总效应是二者的加和，拟合优度（GoF）表示模型的质量。分析表明，随着秸秆添加量的增加，秸秆添加与NO3-含量和pH呈显著负相关，其中，与NO3-含量负相关系数最大（-0.93）。NO3-含量与群落结构显著正相关（0.65），与基因丰度呈负相关（-0.69），表明秸秆添加后，固氮微生物对土壤NO3-的利用导致了群落结构的显著变。此外，群落结构与BNF显著负相关（-0.87），表明在群落结构改变后，对BNF造成显著影响。尽管pH在秸秆添加后显著变化且与BNF有着直接的显著相关性，但与间接效应相抵消后，pH对BNF总效应仅为0.43。通过观察各变量之间的总效应，可以发现秸秆添加（0.67）、NO3-（-0.89）及微生物群落结构（-0.87）对生物固氮速率影响较大；秸秆添加（-0.85）及NO3-（-0.70）对微生物群落结构影响较大。

***，**，*分别表示P＜0.001，P＜0.01，P＜0.05。图3同 ***, **, * mean P＜0.001, P＜0.01, P＜0.05 respectively. The same as Fig.3

表2 环境因子与土壤固氮微生物丰度、多样性和固氮速率的相关性分析

粗体数字表示相关性显著，＜0.005

The bold numbers represent significant correlations with＜0.005

图3为固氮微生物优势功能菌属与土壤理化性状及生物固氮速率的Spearman相关性分析。分析表明，属水平上大多数优势土壤固氮微生物相对丰度与土壤硝态氮及生物固氮量显著相关。其中，土壤中的优势功能菌属（＞1%）、、sp.、和等属与生物固氮速率呈显著正相关，此外，等属也与生物固氮速率呈显著正相关，但其相对丰度为较低水平；而、、和sp.等属与生物固氮速率呈显著负相关。NO3--N对菌属相对丰度影响与BNF的趋势相反，且有着较强的相关性，土壤pH的趋势和NO3--N类似，如和sp.相对丰度与BNF呈显著正相关，而与NO3--N和pH呈显著负相关。

图3 土壤固氮微生物功能菌属与土壤理化性状及固氮速率的Spearman相关性分析

3 讨论

许多研究表明，秸秆添加后补充的大量有机碳源和能量会导致土壤中微生物群落利用无机态氮，提高土壤中细菌和非共生固氮微生物的数量和活性[10-11]，从而促进生物固氮[12-13]。有机物料添加有利于促进基因丰度及固氮功能的维持[43-45]，但其对固氮微生物的影响可能也与有机物料的数量有关[46]。在本研究中，与C0相比，除C1（0.2 mg·g-1）处理固氮速率增加不显著外，其余处理固氮速率均显著提高，但随着秸秆添加量增加到C3（2.0 mg·g-1）水平后，固氮速率不再显著增加。秸秆中含有纤维素和半纤维素，土壤中只有少数几种固氮微生物（）能够直接利用秸秆进行固氮[47]，大多数固氮微生物依赖于其他微生物将其分解为较小的产物。过量秸秆的添加并不代表其满足微生物生长所需的可利用碳源，进而导致固氮速率不再显著增加。相关性分析表明固氮速率与NO3--N含量呈显著负相关（表2），与秸秆添加量呈显著正相关。此外，固氮速率与TN含量呈显著正相关可能归因于秸秆添加输入的大量有机氮源。

碳源的数量是导致微生物群落竞争的重要因子，很大程度上决定了微生物活性和群落结构组成[48]。本研究中，当秸秆添加量达到C4水平后，增加秸秆添加量对基因丰度无显著影响（图1-B）。相关性分析表明，基因丰度与秸秆添加量呈显著正相关，与NO3--N含量呈显著负相关（＜0.001）。以往的研究发现固氮速率显示出对固氮微生物多样性增加的饱和趋势[15]。在本研究中也发现了类似的趋势，当秸秆添加量达到C3水平后，香农-威尔指数显著下降，表明随着秸秆的过量添加，碳源可利用性的限制导致了固氮微生物的群落竞争，群落多样性显著下降。

以往的研究表明参与玉米秸秆分解的微生物主要包括变形杆菌、厚壁菌及放线菌，如、和等[35]。、及Cyanobacteria是土壤中较为常见的固氮微生物[38]。在本研究中，固氮微生物主要包含多种α-型、β-型、γ-型变形菌（Proteobacteria），以及蓝细菌（Cyanobacteria）。在属水平上主要由、、、、和等属组成。其中，可参与秸秆分解且为最丰富菌属，不仅可与豆科植物共生固氮，作为根际细菌也可促进非豆科植物生长[49]，随着秸秆添加量的增加，其相对丰度显著增加了12.07%—14.13%（图1-E）。、和等属的相对丰度随着秸秆添加量逐渐增加，但当秸秆添加量一定水平后其相对丰度反而显著降低（＜0.05）。随着秸秆添加量的增加，、、和等属相对丰度呈下降趋势。作为优势菌属，与生物固氮速率呈显著正相关（＜0.05），但其与固氮速率的相关性不如，这可能与其作为兼性固氮菌，会优先支持自身营养生长而不是用于固氮有关；同时，秸秆添加有增加相对丰度的趋势，其与生物固氮速率呈显著正相关（＜0.01），进一步表明碳源的数量对固氮微生物群落结构的影响。此外，sp.、和等属与BNF均呈显著正相关。上述结果表明，碳源的数量是影响土壤固氮微生物群落特征的关键因素。

除了上述分析，本研究还采用了PLS-PM分析和RDA分析方法，结果均表明土壤固氮微生物群落结构的差异与NO3--N含量紧密相关。之前的研究表明，当铵态氮含量较低的情况下投入有机物料，硝态氮的利用更加显著，进而导致土壤NO3--N含量下降[50]。结合Spearman相关性分析结果，说明随着秸秆量的增加，导致土壤中硝态氮的降低，与生物固氮速率呈显著正相关且与硝态氮呈显著负相关的功能菌属诸如和sp.等菌属的相对丰度显著增加，从而促进了固氮微生物对N2的固定。固氮微生物群落多样性在秸秆添加量达到C3水平后显著下降（图1-C），生物固氮速率在秸秆添加量达到C3水平后无显著差异（表1），虽然表明碳源可利用性对生物固氮的制约，但添加秸秆后在培养期间（28 d）潜在固氮总量可达到2.71—3.05 μg N·g-1DW，约为0.10—0.11 mg N·kg-1DW·d-1，相比C0固氮速率提高了35.5%—52.5%。以上结果说明了适量添加秸秆后可显著提高生物固氮潜力并改变固氮菌群落结构特征。

据统计，2011年，我国通过秸秆还田投入有机碳储量平均为0.89 Mg C·hm-2 [51]，秸秆资源对促进生物固氮潜力有十分积极的意义。本研究表明，C0处理固氮速率为0.07 mg N·kg-1DW·d-1，若以平均土壤容重1.2 g·cm-3来计算，固氮速率约为63 kg N·hm-2·a-1；C3、C4和C5处理固氮速率约为87—96 kg N·hm-2·a-1。与以往研究不同的是，本研究通过15N2方法进行定量，肯定了非共生固氮在水分和温度适宜的条件下对氮素投入的重要作用；土壤固氮微生物多样性在秸秆添加量达到C3（2.0 mg·g-1）水平后显著下降，与固氮速率显著正相关的部分优势功能菌属相对丰度在秸秆添加量达到C4（4.0 mg·g-1）水平后显著下降。为尽可能提高土壤生物固氮潜力，综合考虑固氮微生物多样性、基因拷贝数及生物固氮速率等条件，在本研究基础上得出最佳秸秆添加水平应为4.0 mg·g-1，其潜在固氮总量约为87 kg N·hm-2·a-1，相比对照提高了38.1%。本研究结果进一步表明，土壤固氮微生物多样性及群落结构对碳源数量具有明显响应，可明显提高土壤固氮潜力，对秸秆还田数量调节土壤固氮微生物群落结构及促进生物固氮具有重要指导意义。然而，由于固氮微生物对环境变化十分敏感，田间条件下秸秆还田对固氮微生物群落及生物固氮的调控作用尚需进一步研究。

4 结论

不同秸秆添加量对土壤固氮菌群落特征具有明显影响，添加秸秆后，土壤固氮微生物基因拷贝数呈增加趋势，土壤固氮微生物多样性在秸秆添加量达到2.0 mg·g-1后显著下降，与固氮速率显著正相关的部分优势功能菌属相对丰度在秸秆添加量达到4.0 mg·g-1后显著下降。相比于不添加秸秆，添加秸秆4.0 mg·g-1后，可增加土壤生物固氮速率约为26 kg N·hm-2·a-1。固氮微生物群落结构因秸秆添加量不同而聚集为不同组别。因此，秸秆添加对固氮微生物多样性和群落结构的调控作用主要受碳源的数量影响。此外，固氮微生物群落结构及优势功能菌属相对丰度与固氮速率及NO3--N含量紧密相关，表明秸秆添加后因其较高的C/N比，使得固氮微生物增加对无机态氮（NO3--N）的利用，显著提高固氮微生物的数量和活性，从而促进生物固氮。此外，秸秆添加后造成土壤NO3--N含量的差异可能是驱动土壤固氮微生物群落组成的重要环境因子。

[1] VITOUSEK P M,MENGE D N, REED S C, CLEVELAND C C. Biological nitrogen fixation: rates, patterns and ecological controls in terrestrial ecosystems. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences, 2013, 368(1621): 20130119.

[2] CLEVELAND C C, TOWNSEND A R, SCHIMEL D S, FISHER H, HOWARTH R W, HEDIN L O, PERAKIS S S, LATTY E F, VON FISCHER J C, ELSEROAD A, WASSON M F. Global patterns of terrestrial biological nitrogen (N2) fixation in natural ecosystems. Global Biogeochemical Cycles, 1999, 13(2): 623-645.

[3] GALLOWAY J N, TOWNSEND A R, ERISMAN J W, BEKUNDA M, CAI Z, FRENEY J R, MARTINELLI L A, SEITZINGER S P, SUTTON M A. Transformation of the nitrogen cycle: recent trends, questions, and potential solutions. Science, 2008, 320(5878): 889-892.

[4] HERRIDGE D F, PEOPLES M B, BODDEY R M. Global inputs of biological nitrogen fixation in agricultural systems. Plant and Soil, 2008, 311(1/2): 1-18.

[5] LADHA J K, TIROL-PADRE A, REDDY C K, CASSMAN K G, VERMA S, POWLSON D S, VAN KESSEL C, DE B R D, CHAKRABORTY D, PATHAK H. Global nitrogen budgets in cereals: A 50-year assessment for maize, rice, and wheat production systems. Scientific Reports, 2016, 6(1): 1-9.

[6] ROPER M M, GUPTA V V S R. Enhancing non-symbiotic N2fixation in agriculture. The Open Agriculture Journal, 2016, 10(1): 7-27.

[7] GOOD A G, BEATTY P H. Fertilizing nature: a tragedy of excess in the commons. PLoS Biology, 2011, 9(8): e1001124.

[8] ZENG J, LIU X J, SONG L, LIN X G, ZHANG H Y, SHEN C C, CHU H Y. Nitrogen fertilization directly affects soil bacterial diversity and indirectly affects bacterial community composition. Soil Biology & Biochemistry, 2016, 92: 41-49.

[9] BEATTY P H, GOOD A G. Plant science. Future prospects for cereals that fix nitrogen. Science, 2011, 333(6041): 416-417.

[10] 杨滨娟, 黄国勤, 钱海燕. 秸秆还田配施化肥对土壤温度、根际微生物及酶活性的影响. 土壤学报, 2014, 51(1): 150-157.

YANG B J, HUANG G Q, QIAN H Y. Effects of straw incorporation plus chemical fertilizer on soil temperature, root micro-organisms and enzyme activities. Acta Pedologica Sinica, 2014, 51(1): 150-157. (in Chinese)

[11] GUPTA V V S R, ROPER M M, ROGET D K. Potential for non-symbiotic N2-fixation in different agroecological zones of southern Australia. Soil Research, 2006, 44(4): 343-354.

[12] 赵亚丽, 郭海斌, 薛志伟, 穆心愿, 李潮海. 耕作方式与秸秆还田对土壤微生物数量、酶活性及作物产量的影响. 应用生态学报, 2015, 26(6): 1785-1792.

ZHAO Y L, GUO H B, XUE Z W, MU X Y, LI C H. Effects of tillage and straw returning on microorganism quantity,enzyme activities in soils and grain yield. Chinese Journal of Applied Ecology, 2015, 26(6): 1785-1792. (in Chinese)

[13] 潘剑玲, 代万安, 尚占环, 郭瑞英. 秸秆还田对土壤有机质和氮素有效性影响及机制研究进展. 中国生态农业学报, 2013, 21(5): 526-535.

PAN J L, DAI W A, SHANG Z H, GUO R Y. Review of research progress on the influence and mechanism of field straw residue incorporation on soil organic matter and nitrogen availability. Chinese Journal of Eco-Agriculture, 2013, 21(5): 526-535. (in Chinese)

[14] NELSON D R, MELE P M. The impact of crop residue amendments and lime on microbial community structure and nitrogen-fixing bacteria in the wheat rhizosphere. Soil Research, 2006, 44(4): 319-329.

[15] HSU S F, BUCKLEY D H. Evidence for the functional significance of diazotroph community structure in soil. The ISME Journal, 2009, 3(1): 124-136.

[16] TENG Q, SUN B, FU X, LI S, CUI Z, CAO H. Analysis of nifH gene diversity in red soil amended with manure in Jiangxi, South China. The Journal of Microbiology, 2009, 47(2): 135-141.

[17] LINDSAY E A, COLLOFF M J, GIBB N L, WAKELIN S A. The abundance of microbial functional genes in grassy woodlands is influenced more by soil nutrient enrichment than by recent weed invasion or livestock exclusion. Applied and Environmental Microbiology, 2010, 76(16): 5547-5555.

[18] REED S C, CLEVELAND C C, TOWNSEND A R. Functional ecology of free-living nitrogen fixation: A contemporary perspective. Annual Review of Ecology, Evolution, and Systematics, 2011, 42(1): 489-512.

[19] REED S C, TOWNSEND A R, CLEVELAND C C, NEMERGUT D R. Microbial community shifts influence patterns in tropical forest nitrogen fixation. Oecologia, 2010, 164(2): 521-531.

[20] WAKELIN S A, GUPTA V V S R, FORRESTER S T. Regional and local factors affecting diversity, abundance and activity of free-living, N2-fixing bacteria in Australian agricultural soils. Pedobiologia, 2010, 53(6): 391-399.

[21] ROPER M. Field measurements of nitrogenase activity in soils amended with wheat straw. Australian Journal of Agricultural Research, 1983, 34(6): 725-739.

[22] PÉREZ C A, CARMONA M R, ARMESTO J J. Non-symbiotic nitrogen fixation during leaf litter decomposition in an old-growth temperate rain forest of Chiloé Island, southern Chile: Effects of singleversusmixed species litter. Austral Ecology, 2010, 35(2): 148-156.

[23] CUSACK D F, SILVER W, MCDOWELL W H. Biological nitrogen fixation in two tropical forests: ecosystem-level patterns and effects of nitrogen fertilization. Ecosystems, 2009, 12(8): 1299-1315.

[24] WAKELIN S A, COLLOFF M J, HARVEY P R, MARSCHNER P, GREGG A L, ROGERS S L. The effects of stubble retention and nitrogen application on soil microbial community structure and functional gene abundance under irrigated maize. FEMS Microbiology Ecology, 2007, 59(3): 661-670.

[25] FORBES M, BROOS K, BALDOCK J, GREGG A, WAKELIN S. Environmental and edaphic drivers of bacterial communities involved in soil N-cycling. Soil Research, 2009, 47(4): 380-388.

[26] POLY F, RANJARD L, NAZARET S, GOURBIERE F, MONROZIER L J. Comparison ofgene pools in soils and soil microenvironments with contrasting properties. Applied and Environmental Microbiology, 2001, 67(5): 2255-2262.

[27] TANAKA H, KYAW K M, TOYOTA K, MOTOBAYASHI T. Influence of application of rice straw, farmyard manure, and municipal biowastes on nitrogen fixation, soil microbial biomass N, and mineral N in a model paddy microcosm. Biology and Fertility of Soils, 2005, 42(6): 501-505.

[28] ROPER M M, SMITH N A. Straw decomposition and nitrogenase activity (C2H2reduction) by free-living microorganisms from soil: Effects of pH and clay content. Soil Biology and Biochemistry, 1991, 23(3): 275-283.

[29] KEELING A A, COOK J A, WILCOX A. Effects of carbohydrate application on diazotroph populations and nitrogen availability in grass swards established in garden waste compost. Bioresource Technology, 1998, 66(2): 89-97.

[30] ROPER M M, TURPIN J E, THOMPSON J P. Nitrogenase activity (C2H2reduction) by free-living bacteria in soil in a long-term tillage and stubble management experiment on a vertisol. Soil Biology and Biochemistry, 1994, 26(8): 1087-1091.

[31] UNKOVICH M, BALDOCK J. Measurement of asymbiotic N2fixation in Australian agriculture. Soil Biology and Biochemistry, 2008, 40(12): 2915-2921.

[32] KEUTER A, VELDKAMP E, CORRE M D. Asymbiotic biological nitrogen fixation in a temperate grassland as affected by management practices. Soil Biology and Biochemistry, 2014, 70: 38-46.

[33] CHALK P M, HE J Z, PEOPLES M B, CHEN D.15N2as a tracer of biological N2fixation: A 75-year retrospective. Soil Biology and Biochemistry, 2017, 106: 36-50.

[34] GABY J C, BUCKLEY D H. A comprehensive evaluation of PCR primers to amplify thegene of nitrogenase. PLoS One, 2012, 7(7): e42149.

[35] FAN F, YIN C, TANG Y, LI Z, SONG A, WAKELIN S A, ZOU J, LIANG Y. Probing potential microbial coupling of carbon and nitrogen cycling during decomposition of maize residue by13C-DNA- SIP. Soil Biology and Biochemistry, 2014, 70: 12-21.

[36] DABUNDO R, LEHMANN M F, TREIBERGS L, TOBIAS C R, ALTABET M A, MOISANDER P H, GRANGER J. The contamination of commercial15N2gas stocks with15N-labeled nitrate and ammonium and consequences for nitrogen fixation measurements. PLoS One, 2014, 9(10): e110335.

[37] OHYAMA T, KUMAZAWA K. A simple method for the preparation, purification and storage of15N2gas for biological nitrogen fixation studies. Soil Science and Plant Nutrition, 1981, 27(2): 263-265.

[38] GABY J C, RISHISHWAR L, VALDERRAMA-AGUIRRE L C, GREEN S J, VALDERRAMA-AGUIRRE A, JORDAN I K, KOSTKA J E. Diazotroph community characterization via a high-throughput nifH amplicon sequencing and analysis pipeline. Applied and Environmental Microbiology, 2018, 84(4): e01512-17.

[39] HERBOLD C W, PELIKAN C, KUZYK O, HAUSMANN B, ANGEL R, BERRY D, LOY A. A flexible and economical barcoding approach for highly multiplexed amplicon sequencing of diverse target genes. Frontiers in Microbiology, 2015, 6: 731.

[40] VAITOMAA J, RANTALA A, HALINEN K, ROUHIAINEN L, TALLBERG P, MOKELKE L, SIVONEN K. Quantitative real-time PCR for determination of microcystin synthetase e copy numbers for microcystis and anabaena in lakes. Applied and Environmental Microbiology, 2003, 69(12): 7289-7297.

[41] 苟永刚, 余玲玲, 许霞, 王建武. DNA-SIP鉴定甘蔗//大豆间作土壤15N-DNA富集位置的氮循环功能基因qPCR方法. 农业环境科学学报, 2019, 38(1): 140-147.

GOU Y G, XU L L, XU X, WANG J W. Identification of15N-DNA enrichment sites in DNA-SIP to reveal functional genes by qPCR from sugarcanesoybean intercropping soil. Journal of Agro⁃Environment Science, 2019, 38(1): 140-147. (in Chinese)

[42] GABY J C, BUCKLEY D H. A comprehensive aligned nifH gene database: a multipurpose tool for studies of nitrogen-fixing bacteria. Database, 2014, 2014: bau001. https://doi.org/10.1093/database/bau001.

[43] WAKELIN S A, GREGG A L, SIMPSON R J, LI G D, RILEY I T, MCKAY A C. Pasture management clearly affects soil microbial community structure and N-cycling bacteria. Pedobiologia, 2009, 52(4): 237-251.

[44] TANG Y, ZHANG M, CHEN A, ZHANG W, WEI W, SHENG R. Impact of fertilization regimes on diazotroph community compositions and N2-fixation activity in paddy soil. Agriculture, Ecosystems & Environment, 2017, 247: 1-8.

[45] LIAO H, LI Y, YAO H. Fertilization with inorganic and organic nutrients changes diazotroph community composition and N-fixation rates. Journal of Soils and Sediments, 2017, 18(3): 1076-1086.

[46] SCHUTTER M, DICK R. Shifts in substrate utilization potential and structure of soil microbial communities in response to carbon substrates. Soil Biology and Biochemistry, 2001, 33(11): 1481-1491.

[47] HALSALL D M, TURNER G L, GIBSON A H. Straw and xylan utilization by pure cultures of nitrogen-fixingspp. Applied and Environmental Microbiology, 1985, 49(2): 423-428.

[48] BRANT J B, SULZMAN E W, MYROLD D D. Microbial community utilization of added carbon substrates in response to long-term carbon input manipulation. Soil Biology and Biochemistry, 2006, 38(8): 2219-2232.

[49] ANTOUN H, BEAUCHAMP C J, GOUSSARD N, CHABOT R, LALANDE R. Potential of rhizobium and bradyrhizobium species as plant growth promoting rhizobacteria on non-legumes: effect on radishes (L.). Molecular Microbial Mcology of the Soil,1998, 204: 57-67.

[50] BURGER M, JACKSON L E. Microbial immobilization of ammonium and nitrate in relation to ammonification and nitrification rates in organic and conventional cropping systems. Soil Biology and Biochemistry, 2003, 35(1): 29-36.

[51] ZHAO Y, WANG M, HU S, ZHANG X, OUYANG Z, ZHANG G, HUANG B, ZHAO S, WU J, XIE D, ZHU B, YU D, PAN X, XU S, SHI X. Economics- and policy-driven organic carbon input enhancement dominates soil organic carbon accumulation in Chinese croplands. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 2018, 115(16): 4045-4050.

Effects of Straw Addition on Soil Biological N2-Fixation Rate and Diazotroph Community Properties

LI Xu, DONG WeiLing, SONG ALin, LI YanLing, LU YuQiu, WANG EnZhao, LIU XiongDuo, WANG Meng, FAN FenLiang

Institute of Agricultural Resources and Regional Planning, Chinese Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Plant Nutrition and Fertilizer, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Beijing 100081

【】The purpose of this study was to analyze the effects of different straw additions on soil N2-fixation rate and diazotroph community structure, which was crucial for the management of crop residue and mineral fertilizer application in China.【】Using indoor incubation experiment, in addition to the control (C0: 0), a total of 5 straw addition gradients (C1: 0.2 mg·g-1; C2: 1.0 mg·g-1; C3: 2.0 mg·g-1; C4: 4.0 mg·g-1; C5: 10.0 mg·g-1), using the15N2labeling method, and soil samples were collected after 28 days of incubation in dark conditions. As a direct measure of N2-fixation,15N2gas labeling method could quantify the rate of biological N2-fixation, and destined for characterization ofgene marker and diazotroph community by using the Illumina PE250 sequencing and PCR techniques. 【】With the increase of straw addition, the content of NO3--N in soil decreased significantly, while the content of NH4+-N did not change significantly. The pH of soil decreased and the rate of biological N2-fixation increased significantly. C3, C4 and C5 treatments could reach 2.71-3.05 μg N·g-1DW during the incubation period (28 d), which was about 87-96 kg N·hm-2·a-1, compared with C0, the rate of biological N2-fixation increased by 38.1%-52.4%. The copy number ofgene ranged from 5.48×107to 9.20×107copies/(g soil) under all treatments. Compared with C0, the copy number ofgene was significantly increased under C4 and C5 treatments, and the number and activity of diazotroph were significantly increased (＜0.05). However, when the amount of straw added reached 4.0 mg·g-1, increasing the amount of straw had no significant effect on the copy number ofgene of soil diazotroph. With the increase of straw addition, Shannon-Weill index of C4 and C5 levels was significantly lower than that of the other four treatments (＜0.05), and the diversity of the other four treatments had no significant difference. The result of PCoA showed that diazotroph community structure was clustered into different groups depending upon the difference of straw addition. Diazotroph were divided into Proteobacteria,Cyanobacteria, Firmicutes, Actinobacteria and Spirochaetesat the phylum level. As the amount of straw added increases, the relative abundance oftends to increase first and then decrease. At the genus level, there were significant differences in the number of carbon sources among different species.was the most abundant genus. With the increase of straw addition, the relative abundance of C5 was significantly different from that of C0, C1, C2 and C3 (＜0.05), increasing by 12.07%-14.13%. The relative abundance of, which was positively correlated with the rate of biological N2-fixation, gradually increases with the increase of straw addition, but decreased when straw addition reaches C5 level (＜0.05). Meanwhile, PLS-PM analysis, RDA and correlation analysis revealed that the rate of biological N2-fixation and soil diazotroph community were greatly affected by straw addition and soil NO3--N concentration. 【】The rate of soil biological N2-fixation increases with the amount of straw added. The effect of straw on N2-fixation was mainly due to the reduction of NO3--N content in the soil by straw addition, which in turn promoted the diazotroph such as,andgrow. According to the calculation results of this experiment, compared with no straw, after the straw was added (4.0 mg·g-1), the rate of biological N2-fixation could be increased by 26 kg N·hm-2·a-1, which significantly reduced the fertilizer demand.

soil diazotroph; straw returning; the rate of biological N2-fixation;15N2labeling method;

10.3864/j.issn.0578-1752.2021.05.010

2020-06-21；

2020-12-16

国家重点研发计划（2016YFD0800707，2016YFD0200109）、国家自然科学基金（41571297）、中央级公益性科研院所基本科研业务费专项（1610132019011，1610132019021）

李旭，E-mail：82101185083@caas.cn。通信作者范分良，E-mail：fanfenliang@caas.cn

（责任编辑 李云霞）