复方丹皮酚纳米乳对裸鼠体内人源肺癌 A549 的影响

刘瑾，杨宗统，隋在云，杨青

(山东省中医药研究院中药药效评价重点实验室，山东 济南 250014)

肺癌是目前发病率和死亡率最高的恶性肿瘤[1]，分为小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)，其中NSCLC患者占85%以上[2]，大部分肺癌患者首诊时已处于中晚期[3]，无法通过手术根治，化疗、放疗仍是NSCLC 的主要治疗手段，由于药物的毒副作用大且费用高，难以达到理想的治疗效果。因此寻找一种对肿瘤细胞有高效的杀伤或抑制作用，而对正常细胞无毒性或有保护作用的治疗药物显得尤为重要。现代医学研究表明中医药在治疗肺癌方面有诸多优势，特别是中药复方，具有多环节、多靶点、多层面防治癌症的特点，并且毒性小，副作用低，可有效改善临床症状，提高患者的生活质量，延长生存期[4-5]。本课题组以纳米乳给药系统为载体，通过最佳配伍筛选，将脂溶性丹皮酚和水溶性灵芝多糖作为有效成分制成复方丹皮酚纳米乳，前期研究发现其既有抗肿瘤作用，又有增强免疫作用，可抑制A549细胞的增殖，诱导细胞周期阻滞和细胞凋亡[6]。本文通过建立人源肺癌 A549裸鼠移植瘤模型，给予不同剂量的复方丹皮酚纳米乳进行治疗，探讨复方丹皮酚纳米乳对该肺癌模型的影响，并通过检测裸鼠血清白细胞介素2(IL-2)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)表达水平初步探讨其体内抗肿瘤机制，以期为其临床应用提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 动物、细胞株与饲料 BALB/c Nude裸鼠60只，4周龄，体重10～16 g，雌雄各半，北京维通利华实验动物技术有限公司提供，实验动物质量合格证号：SCXK(京)2016-0006。人非小细胞肺癌细胞株(A549细胞)，购自国家实验细胞资源共享平台。SPF大小鼠生长繁殖饲料，北京科澳协力饲料有限公司，批号：18033313。

1.2 药物与试剂 复方丹皮酚纳米乳(丹皮酚的平均含量为7.612 g·L-1，灵芝多糖的平均含量为6.127 g·L-1)，山东省中医药研究院制剂室提供。康莱特注射液，浙江康莱特药业有限公司，批号：1706247-2，规格：100 mL∶10 g。BD Matrigel基质胶(高浓度，康宁公司)、RPMI-1640培养液(美国Hyclone)、胎牛血清(杭州四季青生物工程材料公司)、四甲基偶氮唑蓝(MTT,Amresco公司)。小鼠IL-2高敏ELISA试剂盒和小鼠TNF-α高效ELISA试剂盒(杭州联科生物技术有限公司)。

1.3 仪器 SW-CJ-2FD超净工作台(AITTECH公司)；BDS200-PH倒置显微镜(奥特光学公司)；IL-16CI二氧化碳培养箱(STIK公司)；细胞计数板(上海光学仪器设备厂)；FA1204B电子天平(上海精科天美科学仪器有限公司)；离心机(美国BECKMAN公司)；xMark酶标仪(美国BIO-RAD公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 A549裸鼠移植瘤模型的建立 人非小细胞肺癌A549细胞，在37 ℃，5%CO2、饱和湿度条件下，用含10%胎牛血清、1%双抗的1640培养基传代培养，将细胞培养到对数生长期，胰酶消化，PBS 清洗，离心收集，用生理盐水调整细胞浓度至2×107个/mL，按照1∶1的比例加入BD Matrigel基质胶，每只裸鼠右侧腋窝皮下注射0.2 mL。进出针的方式为45度斜刺入皮下，与皮肤平行约 1 cm 距离，再进入腋窝。注射结束后，为防止液体溢出，用无菌棉球按压出针处5 s，所有裸鼠接种在0.5 h内完成。预留10只裸鼠作为正常对照组。接种后逐日观察移植瘤的生长情况，待移植瘤体积大于100 mm3，移植瘤模型建立完成。

1.4.2 动物分组与给药 于移植瘤体积达100 mm3以上时，将造模成功裸鼠随机分成荷瘤对照组、康莱特注射液14 mL·kg-1(1 400 mg· kg-1)组、复方丹皮酚纳米乳48、96、192 mg·kg-1剂量组。康莱特注射液组腹腔注射给予康兰特注射液0.14 mL/10 g，复方丹皮酚纳米乳各剂量组腹腔注射等体积药物，正常对照组与荷瘤对照组腹腔注射等体积生理盐水。每天1次，连续给药15 d。

1.4.3 观察指标

1.4.3.1 裸鼠一般情况观察 每天观察裸鼠精神、活动、饮食等一般情况。

1.4.3.2 肿瘤体积测定及质量测定 从给药当天开始，每5 d 称量并记录裸鼠体质量，并用游标卡尺测量移植瘤的最大直径(a)和最小直径(b)，计算肿瘤体积(V=a×b2/2)，绘制移植瘤的生长曲线。治疗结束后，颈椎脱臼处死裸鼠，完整剥离肿瘤组织，电子天平称肿瘤质量，并计算抑瘤率[抑瘤率=(对照组平均瘤质量-给药组平均瘤质量)/对照组平均瘤质量×100%]。

1.4.3.3 血清IL-2、TNF-α含量测定 治疗结束后，禁食不禁水12 h，摘眼球取血，3 000 r·min-1离心15 min，分离血清，按ELISA检测试剂盒操作说明测定450 nm最大吸收波长和570 nm参考波长下的OD值，校准后的OD值为450 nm的测定值减去570 nm的测定值，并根据所配制的标准曲线计算样本中IL-2和TNF-α 的含量。

2 结果

2.1 复方丹皮酚纳米乳对人肺癌A549裸鼠移植瘤生长的影响 治疗过程中各组裸鼠饮食、行为和精神状态均未见明显异常，各给药组裸鼠体质量与正常对照组和荷瘤对照组相比也未见明显差异。由表1结果可见，实验期间各组裸鼠移植瘤体积均不同程度的增长，其中荷瘤对照组移植瘤生长迅速，复方丹皮酚纳米乳各组及康莱特注射液组移植瘤生长相对缓慢；与荷瘤对照组比较，复方丹皮酚纳米乳高剂量组药后5、10、15 d肿瘤体积明显减小(P<0.05、P<0.05、P<0.01)，康莱特注射液组药后10、15 d肿瘤体积明显减小(P<0.05、P<0.01)。由表2结果可见，复方丹皮酚纳米乳各剂量组及康莱特注射液组裸鼠肿瘤质量比荷瘤对照组均有所降低，复方丹皮酚纳米乳高剂量组和康莱特注射液组肿瘤质量较荷瘤对照组明显减轻(P<0.05、P<0.01)，抑瘤率分别达32.95%和34.19%。以上实验结果说明，复方丹皮酚纳米乳在体内能够抑制人肺癌A549裸鼠移植瘤的生长，具有一定的抗肿瘤作用。

表1 复方丹皮酚纳米乳对人肺癌A549裸鼠肿瘤体积的影响

表2 复方丹皮酚纳米乳对人肺癌A549裸鼠肿瘤质量及抑瘤率的影响

2.2 复方丹皮酚纳米乳对人肺癌A549裸鼠血清IL-2、TNF-α含量的影响 由表3结果可见，与正常对照组比较，荷瘤对照组裸鼠血清IL-2、TNF-α表达水平均明显降低(P<0.001、P<0.001)。与荷瘤对照组比较，复方丹皮酚纳米乳高剂量组和康莱特注射液组裸鼠血清IL-2表达水平明显升高(P<0.01、P<0.01)，复方丹皮酚纳米乳中、高剂量组和康莱特注射液组裸鼠血清TNF-α表达水平明显升高(P<0.05、P<0.01、P<0.01)。

3 讨论

本研究前期体外实验结果显示，复方丹皮酚纳米乳呈时间-剂量依赖性地抑制肺癌A549细胞的增殖，抑制肿瘤细胞从G0/G1期向S期转变，并诱导肿瘤细胞凋亡[6]。由于肿瘤细胞在体内外的生长环境不同，研究所得出的结论具有一定的局限性。为了进一步评价复方丹皮酚纳米乳对肺癌的作用，本研究通过建立人源肺癌 A549裸鼠移植瘤模型，给予不同剂量的复方丹皮酚纳米乳进行治疗。实验结果表明，复方丹皮酚纳米乳对人肺癌A549裸鼠移植瘤体积增长和肿瘤质量具有一定的抑制作用，抑瘤率在10.89%～32.95%之间，其中复方丹皮酚纳米乳在高剂量水平下抑制作用最佳，呈现一定的量效关系，这与体外实验的研究结论一致，为复方丹皮酚纳米乳抗肺癌研究提供了新的实验依据。

表3 复方丹皮酚纳米乳对人肺癌A549裸鼠血清IL-2、TNF-α含量的影响

肿瘤的发生发展与机体的免疫功能密切相关，血清中的IL-2主要由T细胞分泌，是肿瘤免疫治疗的重要细胞因子。IL-2能增强T细胞的杀伤活性，不仅能在体外直接杀伤肿瘤细胞[7]，并可诱导T细胞分泌IFN-γ、TNF、CSF等细胞因子增强抗肿瘤活性[8]。本实验研究结果表明，复方丹皮酚纳米乳可有效提高裸鼠血清中的IL-2含量，从而减少体内的肿瘤细胞。TNF-α是一种由激活的巨噬细胞产生的可直接杀伤肿瘤细胞的细胞因子，也是迄今为止发现具有杀伤肿瘤细胞活性最强的细胞因子。有研究报道，TNF-α能够激活CD8+T细胞、NK细胞及LAK细胞等释放穿孔素和IFN-γ，从而对肿瘤细胞发挥毒性作用，促使肿瘤的消退[9-10]。本实验结果表明，复方丹皮酚纳米乳可通过提高裸鼠血清中的TNF-α含量，增强抗肿瘤效应。

综上所述，复方丹皮酚纳米乳可抑制肿瘤细胞增殖，促进细胞因子IL-2和TNF-α表达，初步揭示了其抑瘤作用机理可能与免疫调节有关。本实验研究结果显示复方丹皮酚纳米乳的抗肿瘤作用以高剂量水平治疗效果最佳，由于实验过程中剂量设置范围较窄，并不能确定复方丹皮酚纳米乳的最佳治疗剂量，对其抗肿瘤作用机制也仅进行了初步探讨，所以复方丹皮酚纳米乳对人源肺癌A549裸鼠移植瘤的最佳治疗剂量和抗肿瘤作用机制仍需进一步研究。