夹心酶联免疫吸附试验法与PCR 法对检测牛I 型疱疹病毒结果的比较研究

张光磊，魏田田，高 月，梁云坤

吉林省敦化市农业农村局畜牧站，吉林敦化 133700

牛I 型疱疹病毒是在α-疱疹病毒亚科中水痘类病毒的成员，属于疱疹病毒科家族。该病毒发病伴随多种临床表现,包括：牛传染性鼻气管炎、外阴道炎、龟头包皮炎、流产、结膜炎以及普通性的全身感染。最主要的经济影响是在妊娠后半段牛传染性气管炎流产所产生的损失，并且常常没有任何其他的临床征兆。BHV-1 病毒可潜伏在三叉神经节的感觉神经元中，主要感染源是鼻腔渗出物和飞沫、生殖分泌物、精子以及肽液。BHV-1 病毒感染主要通过PCR 分离病毒和血清学实验进行诊断，常用血清中和检测法进行试验，但该方法费时费力缺乏敏感性。在本研究中，我们论述了夹心酶联免疫吸附试验对检测牛I 型疱疹病毒的结果，使之能够简单、快速、有效地检测出BHV-1 病毒感染。

1 材料与方法

1.1 病毒和细胞培养。

1.2 病毒浓度和纯度测定。

1.3 兔和豚鼠抗体血清的制备。

1.4 ELISA 检测。

1.5 抗体最佳稀释浓度的测定。

1.6 过氧化物结合物最佳稀释浓度测定。

2 结果

最佳抗体稀释浓度用滴定盘确定，兔抗血清在稀释比例为1:1 000、1:2 000、1:4 000 时，吸光度（A490）要高于同稀释比例豚鼠的检测抗体血清（高于1.5）；而在兔和豚鼠抗体中更高的稀释比例（1:8 000,1:16 000，1:64 000.1:128 000）显示吸光度（A490）显著下降至1.5 以下，抗体稀释浓度比例为1:128 000 时，吸光度值甚至低于0.1。因此，在ELISA 准备实验前用1:4 000 稀释比例为最佳稀释浓度。

通过对比PCR 检测结果来测定该方法的临界点，用共95 个检测样本，58 个PCR 阴性样本作为阴性标准。临界值算法用PCR 阴性样本的OD 值加三倍标准差。因此，阳性反应的临界值确定为0.143，约为0.15。阴性样本中阳性与阴性的比值为1.3。

表1 Sandwich ELISA 法与PCR 法检测BHV-1 病毒结果的比较

通过PCR 法和ELISA 法检测95 个实验样本，在37 个PCR 阳性样本中采取ELISA 法检测出3个阴性样本；在58 个PCR 阴性样本中用ELISA法检测出4 个阳性样本。敏感性：（34/34+3）×100%=91.9%；特异性：(54/4+54)×100%=93.1%。

3 讨论

本研究的目的在于探讨夹心酶联免疫吸附试验法能否检测牛BHV-1 病毒。在任何一种新型ELISA系统里，最佳实验条件是通过不同参数的变化来确定的。兔以及豚鼠的抗血清是通过密度梯度离心纯化的BHV-1 病毒收集的，如果颠倒顺序就会导致非特异性结合物的产生。在一些通过采取高纯度的IgG 分泌物获得的抗血清在一些实验中表现出无特异性，可能是因为血清中IgG 的片段里参杂了一些未被排除的IgM 片段，从而使实验产生非特异性反应。