基于DNA条形码探究盗条蜂Anthophora plagiata(Illiger,1806)的物种界定*

张丹 牛泽清 吴清涛 达娃 朱朝东**

（1.中国科学院动物研究所动物进化与系统学院重点实验室；2.中国科学院大学生命科学学院，北京 100000；3.西藏自治区高原生物研究所，西藏 拉萨 850000）

蜜蜂总科物种丰富，分布广泛，在农林生态系统中具有重要的作用[1-4]。根据Ascher等人统计，目前全世界已被描述的蜜蜂物种超过24000 种[5]。中国目前已记述种类为1432种，还有大量的物种待发现。在物种鉴定和系统发生关系的解决过程中，物种的概念以及物种的界定仍是生物系统学以及分类研究中最基本的问题[6]。甚至对于同一个研究类群，不同的研究人员可能界定物种的标准也有差异。随着多学科的结合与发展，关于物种概念的争论与解释一直存在，尤其是对于近缘种和隐存种的界定问题。

盗条蜂（Anthophora plagiata）中胸背板及腹部体毛颜色差异较大（从灰白色至狐红色）。在前人的研究中，不同的学者根据体毛颜色的差异将其划分为不同的物种[1]。根据生物学物种概念，一般认为同一个物种雄性生殖器结构形同。对于雄性物种，可以通过解剖生殖器，根据其结构来判断是否是相同的种[7]，但对于雌性个体，这种外表特征的变化，例如盗条蜂体毛颜色的变化，在一定程度上很难判断是种内还是种间变异。

在过去的十几年中，DNA条形码技术已发展成为一种成熟的技术，在生物学等相关领域得到广泛应用，同时也为生物分类学的发展带来新的机遇[8]。研究者们通过DNA条形码的方法，发现很多类群存在隐形种，例如对欧洲蝴蝶隐形种多样性的研究[9]；除了隐存种，通过DNA条形码技术可以将全变态昆虫幼虫和成虫相联系，这一方法已在水生昆虫的鉴定与检测等方面广泛应用[10]；DNA 条形码技术的发展也为蜜蜂总科物种雌雄配对问题找到了一个突破口[11-13]，例如，2010 年Gibbs 等人在对加拿大淡脉隧蜂属（Lasioglossum）的研究中，利用DNA 条形码技术对该属物种进行雌雄配对，为后续该属的研究奠定了基础[14]。

本研究中我们结合形态学特征和DNA 条形码技术，研究盗条蜂（蜜蜂总科：蜜蜂科：条蜂属）的毛色变异，探讨不同毛色的个体是否为同一个物种的问题。

1 材料方法

1.1 标本采集

标本采集时间为2019—2020 年6 月、7 月和8 月，采集地点主要包括西藏自治区（定日县、聂拉木、普兰县、亚东县）以及青海省（格尔木市）。本研究主要以扫网的方法采集标本，将采集到的标本放入装有硅胶的冻存管中，并制作干制标本。

1.2 形态学鉴定

本研究中共计检视22 头盗条蜂标本。所有检视标本都储存在中国科学院动物研究所标本馆。本研究所用检视标本的显微镜为：Nikon SMZ1500 检视标本，并连接Nikon D7000 数码相机多张拍摄，然后利用Helicon Focus 对照片进行叠加，合成清晰的照片，后期使用Photoshop CS6软件合成图版。

1.3 样本DNA提取、扩增及测序

将所有采集的标本制成针插标本以后，选取其中12头标本进行分子测序（见表1）。取标本右侧中足置于1.5ml 的离心管中加无水乙醇保存，将其带回实验室后，测定其一段线粒体细胞色素C 氧化酶亚型I 基因序列（cytochrome oxidase subunit I,COI）。在DNA提取前，加液氮至离心管研磨样本至粉末状。本研究使用DNeasy Blood＆Tissue Kit（Qiagen GmbH，Hilden，Germany）试剂盒严格按照其说明书要求进行基因组DNA 提取。COI 基因所用引物为C1-J1514 和C1-N2194[15-16]；聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction,PCR）体系为30ul 体系（COI）：10μl ddH2O、15μl Premix TaqTM（LA TaqTMversion2.0plus dye）（TaKaRa）、1ul 单向引物（10μM）、3μl DNA 模板；反应体系如下：94℃解链2 分钟、45℃退火40 秒、72℃延伸1 分钟（4个循环）、94℃解链40 秒、50℃退火40 秒、72℃1 分钟（35 循环），72℃终延伸6 分钟。获取PCR 产物后，经琼脂糖凝胶电泳（浓度1%）观察后，将条带清晰的PCR 原液送至公司双向测序（测序仪规格：BigDye v3.1,ABI 3730xl DNA 分析仪）。

表1 分子测序样本信息表

1.4 序列比对、物种界定及系统发生分析

获得序列以后，将每条序列上传至NCBI(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgiz)进行初步比对，以确保每条数据都为蜜蜂科物种的序列。之后通过BioEdit［17］使用ClustalW进行比对。由于COI是蛋白质编码基因，我们使用MEGA 7［18］检测是否有终止密码子的存在，并辅以手动调整。

本研究采用ABGD 的方法对物种整理好的序列进行物种界定。将比对好的序列，提交至ABGD［19］在线分析网站（https://bioinfo.mnhn.fr/abi/public/abg-d/），参数设置如下：Pmin=0.001,Pmax=0.1,Steps=50,X=0.5,Nb bins=50,遗传距离模型为K80。

本研究利用IQ-TREE［20］构建最大似然法系统发育树（ML），调用内置ModelFinder 计算最佳模型为GTR+I+G，选择吴氏条蜂Anthophora wuae(Brooks,1988)为外群。

2 结果

2.1 形态学结果

盗条蜂Anthophora(Melea)plagiata(Illiger,1806)

Megilla plagiataIlliger,1806:140,♀.

Apis parietinaFabricius,1793:323.(Homonym).

Anthophora villosaHerrich-Schäffer,1840:73,♂.

Anthophora parietinavar.fulvocinereaDours,1869:168,♀,♂.

Anthophora turanicaFedtschenko,1875:10,♀.

Anthophora parietinavar.schenkiiDalla Torre,1877:162.

Anthophora simplicipesMorawitz,1880:344,♂.

Anthophora mlokosewitziRadoszkowski,1884b:24-25,♀.

Anthophora nigripesMorawitz,1887:205,♀.(Homonym).

Podalirius simplicipes semiaterFriese,1897:268,♀.

Anthophora pulcherrimaBingham,1897:532-533,♀,♂.

Podalirius parietinus nigrescensFriese,1897:270,♀.

Anthophora filchneraeFriese,1908:98,♂.

Anthophora khambanaCockerell,1910b:415,♀.

Anthophora khambanavar.atramentataCockerell,1911i:177,♀.

Anthophora pilosellaFriese,1919:278,♀,♂.

Anthophora semenoviKuznetzov-Ugamsky,1927:329.

Anthophora parietina pamiricolaHedicke,1930b:853,♀,♂.

Anthophora khambana chodjanaHedicke,1938:195.

Anthophora parietina baltistanicaHedicke,1940:85.

Anthophora parietina ladakhanaHedicke,1940:86.

Anthophora pulcherrima himalayaensisWu,1982b:413,♀,♂.

鉴别特征：雌体长12mm～16mm；唇基刻点粗大，唇基中央具纵脊；触角鞭节第一节等长于2～4 节之和；颚眼距宽大于长，长约为宽的2/3；颜面被灰白色或灰黄色或黑色长毛；中胸背板被灰白色或黑色长毛（中胸背板及侧板黑毛较多）；足一般被灰白色、灰黄色或黑色长毛，足内侧毛黑褐色；腹部背板第一节被灰黄色、或黄褐色或黑色长毛，腹部第2～5 节背板变化极大，灰黄色、黄褐色或狐红色（详见图1）。

图1 盗条蜂雌性体毛变换示意图,标尺：A-D：1mm

雄体长10mm～14mm；雄性唇基、上唇均为黄色；后足基跗节内侧端部2/3 处具1 齿状突起；腹部第七背板中央呈半圆形凹陷；雄性同雌性，毛色变化极大，胸部及腹部第一节背板被灰白色、灰黄色、黄褐色或狐红色长毛，腹部背板2～6 节被灰黄色、或狐红色长毛；足被灰白色、灰黄色长毛（图2A-E）；雄性生殖器结构及第7、第8腹板结构见图2F-H［21-22］。

图2 盗条蜂雄性示意图

检视标本：1 ♀1♂，西藏阿里普兰县赤德村（E81.1427,N30.2954），4100m,19-VI-2020,吴清涛，张丹采;6♂，西藏亚东县上亚东乡（E88.9300,N27.5035），3724m,30-V-2020,吴清涛，张丹采;1♀8♂,西藏定日县长所乡（E87.4925,N28.5273），4109m,2-VII-2020,吴清涛，张丹采;1♀,西藏阿里普兰县赤德村（E81.1427,N30.2954），4100m,18-VII-2020,吴清涛，张丹采;1♀,西藏普兰县普兰村（E81.2531,N30.2001），3837m,17-VII-2020,吴清涛，张丹采;1♂,青海格尔木市无极龙凤宫附近（E94.3679,N35.8887），3709m,28-VII-2020,吴清涛，张丹采;1 ♀，西藏吉隆县佩枯措附近（E85.5865,N28.7554），4566m，4-VIII-2019,吴清涛，张丹采;1 ♀，西藏聂拉木县乃龙乡古城堡附近（E86.3519,N28.7757），3859m,29-VII-2019，吴清涛，张丹采。

采访植物记录：Astragalus strictus(劲直黄芪)、Berberis lecomtei（光叶小蘖）、Astragalus adsurgens(斜茎黄芪)。

国外分布：欧洲，中亚。

国内分布：吉林、内蒙古、河北、北京、甘肃、青海、新疆、江苏、浙江、四川、云南、西藏。

2.2 物种界定及鉴定结果

本研究中我们对采自西藏不同地方的12 个盗条蜂样本正反向测序，共计获得COI 序列21 条，通过对序列的比对最后获得COI 序列的长度为576bp。将序列上传至ABGD 网站分析，发现“Barcoding gap”存在于0.01-0.014之间，说明该样本为一个物种。

图3 利用IQ-TREE基于COI基因构建的ML树

本研究中，基于COI 基因的ABGD 分析得到了与形态分类同样的结果，说明对于蜜蜂中的某些类群，毛色并不是一个稳定的形态分类学特征。

致谢

衷心感谢中国科学院动物研究所乔格侠研究员及西藏自治区第二次青藏科考领导小组办公室尹君老师对本研究的大力支持。