响应面优化超声辅助法提取杜仲叶中绿原酸的工艺研究

贾 娟 ，王婷婷 ，傅 航 ，杨雯雯

（1.河南工业大学漯河工学院，河南 漯河 462002；2.漯河职业技术学院，河南 漯河 462002）

杜仲（Eucommia ulmoids）又名木棉、思仲，属杜仲科（Ecommiaceae）落叶乔木植物，是我国特有的经济树种和特有药材，在《神农本草经》和《本草纲目》中对其药用功能都有记载[1]。杜仲具有利尿、消炎、促消化、降血压等功效。一般栽培10～20 年杜仲采用半剥法和环剥法可得到杜仲树皮，经2～3 年后树皮才能重新长成，而杜仲叶价格低廉，比较容易获得[2]。有研究表明，杜仲叶也具有与杜仲基本相同的药用功效，且杜仲叶中也富含绿原酸、黄酮和环烯醚萜类物质等，其绿原酸含量十分丰富，可达1%～5%[3-6]。绿原酸是一种重要的生物活性物质，具有抗菌、抗病毒、升高白血球、保肝利胆、抑制突变和抗肿瘤、降血压、降血脂、抗自由基和抗衰老等作用[7]。

杜仲叶中绿原酸的提取方法包括微波辅助提取法、回流提取、超声波提取法等。微波辅助提取法是利用微波热效应加快绿原酸溶解的一种提取方法，具有快速、高效、加热均匀和操作简单的特点，但同时具有不易自动化的缺点；回流提取法是利用加热回流装置将有机溶剂挥发，而活性成分被提取的一种方法，具有选择性、能耗低、操作简单的优点，但也存在效率较低、耗时等缺点；超声辅助提取主要利用空化效应、机械效应和热效应使植物细胞被破坏，用有机溶剂将胞内活性物质提取出的一种方法，具有提取时间短、温度低、杂质少、提取率高、范围广且能避免胞内物质损失等优点，所以本研究选择超声波法提取杜仲叶中绿原酸。

近些年，国内外已经出现很多提取杜仲中绿原酸的研究，如邓爱华等[7]、任小宁等[8]、张蕾等[9]、赵亚洲等[10]分别采用了溶剂萃取、酶法、超声波法和微波法进行提取，以上的方法普遍对溶剂的浓度、料液比、时间等因素进行优化，影响绿原酸提取率的重要因素并不全面，如液料比、乙醇浓度、提取时间、溶剂pH、提取次数没有同时考虑，尤其是响应面超声波提取杜仲叶中绿原酸的研究鲜有报道。为此，本试验采用响应面法优化超声波辅助提取杜仲叶中的绿原酸，对超声波提取的重要条件同时进行优化，更加系统全面地确定超声波法提取杜仲叶中绿原酸的参数，以期为合理开发利用杜仲资源及绿原酸产品的开发提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料与试剂

杜仲叶：采于河南省南阳市；绿原酸标准品（纯度≥98%）：北京索莱宝科技有限公司产品；无水乙醇（分析纯）：开封市铁塔试剂厂产品；氢氧化钠、盐酸（分析纯）：天津市大茂化学试剂厂产品。

1.1.2 仪器与设备

TGL-16G 型台式离心机：上海安亭科学仪器厂；UV-2600 型紫外可见分光光度计：尤尼柯（上海）仪器有限公司；FA2004 型电子天平：上海上平仪器有限公司；PHS-3CT 型酸度计：上海康仪仪器有限公司；304 不锈钢材质2500c 型粉碎机：永康市艾泽拉电器有限公司；200 mm 60 目标准型分样筛：上虞市新达净化仪器厂；202 型电热恒温干燥箱：北京市永光明医疗仪器厂；SB-800D 型超声波发生器：宁波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 样品预处理

新鲜杜仲叶经过采摘后，自然晾干，置于50 ℃电热恒温干燥箱中12 h，用粉碎机将烘干的样品粉碎后过60 目筛，备用。

1.2.2 绿原酸超声波辅助提取工艺

准确称取等量的杜仲叶，加入不同浓度的乙醇，设置好不同的液料比。调整设定pH，通过设定提取时间和提取的次数，对杜仲叶中绿原酸进行超声波提取[11-12]。

1.2.3 绿原酸超声波辅助提取单因素优化试验

1.2.3.1 液料比的筛选

分别设定pH 为7.0 的70%乙醇溶液与杜仲叶粉末的液料比为 10∶1、12∶1、14∶1、16∶1、18∶1、20∶1（mL/g）（如：液料比为 10∶1（mL/g）是指 10 mL 提取液，1 g 杜仲粉末）提取20 min，研究不同液料比对绿原酸提取率的影响。

1.2.3.2 提取液乙醇浓度的筛选

准确称取1.000 g 的杜仲叶粉末，加入pH 为7.0的 10 mL 30%、40%、50%、60%、70%、80%的乙醇溶液，提取20 min，研究不同浓度乙醇对绿原酸提取率的影响。

1.2.3.3 提取时间的筛选

准确称取1.000 g 的杜仲叶粉末，加入10 mL 70%的乙醇溶液，调整 pH 为 7，分别提取 5、10、20、30 min，研究不同提取时间对绿原酸提取率的影响。

1.2.3.4 溶剂pH 的筛选

准确称取1.000 g 的杜仲叶粉末，加入10 mL pH分别为 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 的 70%乙醇溶液，提取20 min，研究不同pH 对绿原酸提取率的影响。

1.2.3.5 提取次数的筛选

准确称取1.000 g 的杜仲叶粉末，加入pH 为7.0的10 mL 70%的乙醇溶液，提取设定的次数分别为1次、2 次、3 次、4 次和 5 次，每次提取 20 min，研究提取次数对绿原酸提取率的影响。

1.2.4 响应面优化试验设计

在单因素试验结果的基础上，根据Box-Behnken中心组合试验设计原理，以料液比、乙醇浓度、提取时间和提取pH 为考察因素，以绿原酸提取率（Y）为响应值，利用Design Expert 8.0.6 软件进行4 因素3 水平试验，优化超声波法提取杜仲叶中绿原酸的工艺。试验水平编码如表1 所示。

1.2.5 绿原酸含量的测定

1.2.5.1 绿原酸标准曲线的制备

精确称取绿原酸标准品0.02 g，用60%乙醇溶解并定容至100.00 mL 的容量瓶中，即得到0.200 mg/mL的标准液待用。准确移取 0、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20、1.40 mL 标准液于 10.00 mL 的比色管中，用30%的乙醇定容至刻度，得到系列浓度为0、40.0、80.0、120.0、160.0、200.0、280.0 μg/mL 的标准液，摇匀后在紫外可见分光光度计330 nm 处测定其吸光值。测定标准曲线为：y=0.004 7x+0.001 5，R2=0.999 9，结果见图1。

表1 响应面试验水平编码表Table 1 Factors and levels for response surface test

图1 绿原酸标准品标准曲线Fig.1 Standard curve of chlorogenic acid

1.2.5.2 绿原酸含量

精确称取已处理的杜仲叶粉1.000 g，通过设定方法提取绿原酸，移取0.1 mL 提取液，用30%乙醇定容至10 mL，摇匀后在紫外可见分光光度计330 nm处测定其吸光值。根据以下公式计算不同试验组杜仲叶提取物绿原酸提取率。

Y=c×V×10×1 000/m

式中：Y 为绿原酸提取率，%；c 为测定液中绿原酸的浓度，mg/mL；V 为绿原酸浸提液体积，mL；m 为杜仲叶原料的质量，g。

1.2.6 数据处理

使用Excel 2007 对数据进行分析并绘制图表，并利用Design-Expert 8.0.6 软件进行响应面分析。

2 结果与分析

2.1 杜仲叶中绿原酸超声波辅助提取单因素试验

2.1.1 液料比对杜仲叶中绿原酸提取率的影响

由图2 可以看出，绿原酸提取率随着溶剂量的增加先增加后缓慢减少，当液料比为 16∶1（mL/g）时，绿原酸提取率达最高，此后继续增加溶剂，绿原酸提取率趋于稳定并略有下降，说明在一定范围内，绿原酸含量随着溶剂增加而增加，而当绿原酸全部被溶解出即其提取率达到最大值后，再增加溶剂量反而导致绿原酸提取率下降[13]。此外，溶剂添加量过大，会增加成本，故选择液料比为 16∶1（mL/g）。

图2 不同液料比对杜仲叶绿原酸提取率的影响Fig.2 Effect of liquid-solid ratio on the yield of chlorogenic acid from Eucommia ulmoides leaves

2.1.2 乙醇浓度对杜仲叶中绿原酸提取率的影响

由图3 可以看出，绿原酸提取率随着乙醇浓度的增加先升高后缓慢降低，当乙醇浓度为50%时，绿原酸提取率为最高，此后继续增加提取液乙醇浓度，绿原酸提取率开始缓慢下降。这可能是由于杜仲叶中脂溶性物质在高于50%乙醇提取液被溶解出，而造成绿原酸的提取率缓慢下降[14]。故选取溶剂中乙醇浓度为50%左右。

图3 不同提取液乙醇浓度对杜仲叶绿原酸提取率的影响Fig.3 Effect of ethanol concentration on the yield of chlorogenic acid from Eucommia ulmoides leaves

2.1.3 提取时间对杜仲叶中绿原酸提取率的影响

由图4 可以看出，随着提取时间的延长，绿原酸提取率在设定的时间内迅速升高，在20 min 以后基本保持稳定。提取时间越长，绿原酸提取率越高，但到达一定时间，杜仲叶中的绿原酸提取达到饱和。同时，延长提取时间，成本提高，溶剂的逸失也会增加。故选择超声浸提时间20 min 左右。

图4 不同超声浸提时间对杜仲叶绿原酸提取率的影响Fig.4 Effect of ultrasonic time on the yield of chlorogenic acid from Eucommia ulmoides leaves

2.1.4 溶剂pH 对杜仲叶中绿原酸提取率的影响

由图5 可以看出，绿原酸提取率在设定的溶剂pH 范围内呈现先升高后缓慢降低的趋势，pH 为5时，提取率达到最高。这可能是由于在酸性环境中绿原酸较稳定[15]，故选择溶剂pH 为5 左右。

图5 不同溶剂pH 对杜仲叶绿原酸提取率的影响Fig.5 Effect of solvent pH on the yield of chlorogenic acid from Eucommia ulmoides leaves

2.1.5 提取次数对杜仲叶中绿原酸提取率的影响

由图6 可以看出，绿原酸提取率随着提取次数的增加依次升高，但是当提取次数大于3 时，所得浸提液的吸光值基本不变，也就是提取率趋于稳定。此外，浸提次数太多，也会增加成本和影响绿原酸的提取效果。故选择浸提次数为3 次。

图6 不同浸提次数对杜仲叶绿原酸提取率的影响Fig.6 Effect of leaching times on the yield of chlorogenic acid from Eucommia ulmoides leaves

2.2 杜仲叶中绿原酸超声波辅助提取响应面优化试验

2.2.1 响应面试验设计

利用Box-Behnken 设计原理对杜仲叶中绿原酸超声波辅助提取工艺参数进行优化，试验设计及结果如表3 所示。

表3 Box-behnken 试验设计及结果Table 3 Test design and results of Box-behnken method

2.2.2 回归模型方差分析及显著性检验

以提取率Y 为响应值，液料比X1、乙醇浓度X2、提取时间X3、溶剂pH X4为自变量，建立的二次回归方程：

对响应面回归模型进行方差分析，结果见表4。

表4 回归模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

由表4 可见，回归模型的F=13.76，P＜0.000 1，表明超声波法提取绿原酸提取率与4 个因素之间的回归方程极显著[16]。因变量与所考察自变量之间的线性关系显著（R2=0.932 2），调整确定系数说明可解释86.45%相应值的变化，模型失拟项0.108 7＞0.05，不显著，拟合程度好，表示单因素试验结果可以和数学模型模拟良好。一次项X1、X2及二次项的 P 值均小于0.001，达到极为显著水平，表明这些因素对绿原酸提取率的影响极大，且考察因素对响应值的影响不是简单的线性关系。F 值表示的是液料比、乙醇浓度、浸提时间、溶剂pH 这4 个因素对绿原酸提取率的影响程度，F 值越大，说明影响程度越大[17]，可见4 个因素对绿原酸提取率的影响表现为：X2＞X1＞X4＞X3，即乙醇浓度＞液料比＞提取液pH＞提取时间。

2.3 多因素交互作用的响应曲面分析

图7 液料比与乙醇浓度的交互作用对绿原酸提取率影响的响应面图Fig.7 Response surface plot of effect of liquid-solid ratio and ethanol concentration interaction on chlorogenic acid extraction rate

一般来说，等高线图呈椭圆状时表示两因素间的交互作用显著，圆形则相反[18-19]。图7~12 是超声波法提取绿原酸的4 个因素之间交互作用的响应面图。由图7~12 可知，在试验所选择的水平范围内，4 个因素之间的交互作用对绿原酸提取率的影响相似，基本都随着交互因素添加量的增加达到最大值后又降低，其中液料比和乙醇浓度（X1X2）、液料比和溶剂pH（X1X4）、提取时间与溶剂 pH（X3X4）之间的交互作用较明显，这与方差分析的结果相符。

图8 液料比与浸提时间的交互作用对绿原酸提取率影响的响应面图Fig.8 Response surface plot of effect of liquid-solid ratio and extraction time interaction on chlorogenic acid extraction rate

图9 液料比与溶剂pH 的交互作用对绿原酸提取率影响的响应面图Fig.9 Response surface plot of effect of liquid-solid ratio and solvent pH interaction on chlorogenic acid extraction rate

图10 乙醇浓度与提取时间的交互作用对绿原酸提取率影响的响应面图Fig.10 Response surface plot of effect of ethanol concentration and ultrasonic time interaction on chlorogenic acid extraction rate

根据所得到的响应面模型，经Design-Expert 8.0.6 软件处理得到最优工艺为：液料比 16∶1（mL/g），乙醇浓度50%，浸提时间20 min，溶剂pH 5，在此条件下绿原酸提取率为6.338%。同时，在此条件下进行3 组验证试验，绿原酸提取率分别为6.34%、6.36%、6.29%，取平均值为6.33%，与理论值较为接近，表明响应面模型对优化绿原酸的提取工艺可行。

图11 乙醇浓度与溶剂pH 的交互作用对绿原酸提取率影响的响应面图Fig.11 Response surface plot of effect of ethanol concentration and solvent pH interaction on chlorogenic acid extraction rate

图12 提取时间与溶剂pH 的交互作用对绿原酸提取率影响的响应面图Fig.12 Response surface plot of effect of ultrasonic time and solvent pH interaction on chlorogenic acid extraction rate

3 结论

本研究在单因素试验结果的基础上，通过响应面法优化了超声辅助法提取杜仲叶绿原酸工艺，结果表明，杜仲叶绿原酸最佳提取条件为：液料比16∶1（mL/g），乙醇浓度 50%，浸提时间 20 min，溶剂pH 5，在此条件下绿原酸提取率为6.338%。同时在最优工艺条件下重复3 次验证试验，平均值为6.33%，与理论值较为接近，表明超声波辅助技术对杜仲叶中绿原酸进行提取是可行的，提取率较高，这为绿原酸的提取纯化工艺提供了参考，也为绿原酸相关产品的开发和利用提供了理论依据。