儿童哮喘患者炎症因子水平及肺功能变化与SOCS3基因多态性的相关性*

刘阳,朱永杰

1南阳市中心医院儿科(河南南阳 473000)； 2郑州儿童医院急诊科(河南郑州 450053)

支气管哮喘是一种慢性气道炎症性疾病，发病机制涉及多种炎性细胞、炎性因子和炎性介质[1]。以气道高反应性和黏液分泌过多为主要病理表现。世界各国的儿童哮喘的患病率成上升趋势，尤其是年幼儿童[2]。我国儿科哮喘协会曾进行4次全国儿童哮喘患病率的调查，经过比较显示我国儿童哮喘的患病率成逐年增加的趋势[3-6]。因此早期诊断、合理治疗和有效的预防，为减少儿童支气管哮喘和并发症发生具有重要意义。儿童支气管哮喘与炎症反应密切相关，血清检测炎症因子的水平有助于哮喘的诊断[7-11]。遗传因素在哮喘的发生中也起到重要作用，细胞因子信号传导抑制因子3(Suppressor of cytokine signaling 3，SOCS3)，参与许多信号通路的传导，通过诱导炎症因子和抗炎因子在炎症性疾病中发挥重要作用[12-15]。本研究收集在我院小儿呼吸内科接受治疗的124例儿童哮喘患儿，通过检测SOCS3基因rs9914220和rs4969170位点，进一步分析SOCS3基因多态性与儿童哮喘的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2015年1月至2018年6月在我院小儿呼吸内科接受治疗的124例儿童哮喘患儿，男73例，女51例，平均年龄(7.8±2.4)岁。患儿符合儿童支气管哮喘的诊断与防治指南[1]，无其他过敏性疾病，无心脏、肾脏和肝脏等主要器官的功能障碍。未有合并精神疾病的和认知障碍的患儿。收集同时期来我院就诊的健康儿童74例作为对照组，男39例，女35例，平均年龄(7.4±1.8)岁。无哮喘家族史和个人过敏史。本研究经过医院伦理委员会批准，患儿家属同意并签署知情同意书。

1.2 标本收集及检测 入院时抽取空腹肘静脉血5 mL，4 mL置于低温(4℃)离心机中，1 500 r/min，离心15 min，吸取上层血清，至于EP管中，放于-80℃中保存待用。剩余1 mL为抽取DNA检测实验所用，放于-80℃中保存待用。所有检测对象的血清收集完毕后，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测患者血清中白细胞介素(IL)-4、IL-7、IL-10、IL-17和IL-33的水平，具体的实验步骤严格按照试剂盒说明书进行，ELISA试剂盒购于北京天根生化科技有限公司。所有患者接受肺功能检测，包括：1 s用力呼气容积(FEV1)、用力肺活量(FVC)、FEV1/FVC百分比、最高呼气流速(PEF)、残气量/肺活量(RV/TLV)。

1.3 全血基因组DNA抽提及基因多态性检测 将保存的全血样本，置于37℃水浴锅中融化，按照美国Gentra公司提供的PUREGENE全血快速基因组DNA提取试剂盒中300 μL 全血提取基因组DNA的有机溶剂沉淀法进行抽提基因组DNA。抽提的DNA溶解于100 μL DNA水合液中，放置65℃水浴中1 h，然后检测抽提基因组DNA的浓度和纯度。通过Haploview软件、文献查阅等方法选择SOCS3的SNP位点rs9914220和rs4969170，PCR 扩增及延伸引物由Array Designer 软件设计，北京华大基因科技有限公司合成。rs9914220上游引物5′-CACCCCTGGTATGCACTGTGCCGTG-3′，下游引物5′-ACTGATTCTTGGGCAAGTTCAAATA-3′，rs4969170上游引物5′-ACTGGTACCTGGCTTCTCTCAGCCGGGGTC-3′,下游引物5′-CTAGCTAGCTAGGG-GGCGGCATGTAGTGGTG-3′，利用单核苷酸多态性基因分型检测试剂盒(美国赛默飞世尔科技有限公司)检测选取位点的基因多态性。

2 结果

2.1 哮喘组与对照组患儿炎症因子的水平和肺功能检测比较 经过ELISA检测结果显示，哮喘组患儿外周血中IL-4、IL-7、IL-17和IL-33的水平明显高于对照组，IL-10的水平明显低于对照组，组间差异有统计学意义(P<0.001)，见表1。入院时两组患儿检测的肺功能指标如表2所示，哮喘组的通气测定指标FEV1、FVC和PEF明显低于对照组(P<0.001)，且FEV1/FVC比值也显著低于对照组(P<0.001)，哮喘组肺容量检测指标RV/TLV比值显著高于对照组(P<0.001)。

表1 外周血中个炎症因子的检测水平

表2 对照组和哮喘组患儿肺功能检测结果

2.2 SOCS3基因rs9914220和rs4969170位点各基因型频率观察值和期望值的比较 对照组和哮喘组SOCS3基因的rs9914220和rs4969170位点的各基因型频率的观察值和期望值比较差异无统计学意义(P>0.05),表明哮喘组和对照组各基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡。见表3。

表3 哮喘组和对照组各基因型频率观察值和期望值的比较 例(%)

2.3 哮喘组和对照组SOCS3基因rs9914220和rs4969170位点基因型和等位基因频率分布 rs9914220位点CC型、CT型和TT型在对照组中的检出率分别为54.1%、28.4%、17.6%，在哮喘组中的检出率为58.1%、14.5%、27.4%，CC和TT基因型分布在哮喘组和对照组之间差异无统计学意义(P>0.05)，而CT基因型在两组之间差异有统计学意义(2=5.630，P=0.018)。rs4969170位点CC型、CT型和TT型在对照组中的检出率分别为48.6%、31.1%、20.3%，在哮喘组中的检出率为60.5%、15.3%、24.2%，CC和TT基因型分布在哮喘组和对照组之间差异无统计学意义(P>0.05)，而CT基因型在两组之间差异有统计学意义(2=6.886，P=0.009)。两组之间的等位基因频率差异均无统计学意义，见表4。

2.4 对照组和哮喘组基因型单因素logistic回归分析 Logistic回归分析结果显示CT基因与哮喘的发生呈负相关，CT基因为预防哮喘发生的保护性因素。见表5。

表4 哮喘组和对照组rs9914220和rs4969170位点基因型和等位基因频率分布 例(%)

3 讨论

儿童哮喘是较常见的儿科疾病，主要有白细胞介素、白三烯、T淋巴细胞和嗜酸性粒细胞引起的气道炎症反应[16]。在本研究中，哮喘组与对照组相比，IL-4、IL-7、IL-17和IL-33炎症因子的水平升高，IL-10的水平降低。IL-4、IL-7和IL-17可诱导炎症因子和趋化因子的表达，IL-33与其受体结合后可激活核因子-κB(NF-κB)和MAPK信号通路，从而调节炎症反应[17-18]。IL-10对细胞的生长与分化有一定的调节作用，也可直接参与机体的炎症反应和免疫应答，为目前公认的一种炎症和免疫抑制因子[19]。因此，高水平的IL-4、IL-7、IL-17和IL-33和低水平的IL-10可以促进气道高反应的形成，进而引发哮喘。因此，高水平的IL-4、IL-7、IL-17和IL-33和低水平的IL-10可以作为儿童哮喘的监测指标。在哮喘的发病过程中，长期的炎症刺激有利于气道的收缩，导致气道狭窄[20]。在本研究中，哮喘组的通气测定指标FEV1、FVC、FEV1/FVC比值和PEF明显低于对照组，哮喘组肺容量检测指标RV/TLV比值显著高于对照组。哮喘组儿童有明显的气道功能障碍和气流受限这与哮喘的病理特征相符合。因此肺功能的检测在治疗过程中可为哮喘的诊断和治疗疗效提供一定的参考依据。

表5 对照组和哮喘组基因型单因素logistic回归分析

基因异常与儿童哮喘为近年研究的热点，STAT6和TBXA2R基因多态性与哮喘发生风险无关，而与哮喘的临床症状相关[21]。SOCS1、SOCS3 和SOCS5在哮喘患者中的水平有明显的改变，SOCS3的变化较明显，SOCS5的变化较小[22]。SOCS3为SOCS的家庭成员之一，位于染色体17q25.3包含225个氨基酸[23]。SOCS3通过诱导JAK的转化激活剂1和3，参与JAK-STAY信号通路的传导。已有研究显示SOCS3可参与人体的炎症反应、免疫应答及肿瘤的发生和转移[24-26]。T细胞中SOCS3的表达上调与哮喘的严重程度相关，促进过敏反应[27]。在本研究中，我们主要针对SOCS3多态性基因位点rs9914220和rs4969170(C/T)的基因型和等位基因频率的研究。结果显示SOCS3基因rs9914220和rs4969170的CT有差异，logistic单因素方差分析结果显示，CT基因为预防哮喘发病的保护性因素。综上所述，SOCS3基因rs9914220和rs4969170位点的多态性与哮喘的发病有关，CT基因为预防哮喘发病的保护性因素。