细胞免疫应答变化与支气管哮喘疾病进展的相关性分析*

连晓峰,韩鹏,李永锋,许志强,王东傲

1濮阳市安阳地区医院呼吸与危重症医学科(河南安阳 455000); 2河南省人民医院呼吸内科(河南郑州 450003)

支气管哮喘是指患者哮喘疾病急性发作，经过常规治疗后效果不明显或者出现爆发性发作，在很短时间内病情发展至危重状态[1]。支气管哮喘是临床中十分常见的一种危急慢性呼吸系统疾病，主要特点是治疗困难、哮喘持续时间超过1 d、发病急、症状严重、发病率高等，如果得不到及时治疗，极易出现呼吸衰竭、呼吸道阻塞等状况，严重时危及患者生命[2-3]。哮喘疾病预后与患者病程时间长短无关，而与疾病严重程度密切相关。其发作机制主要为炎性细胞和炎性介质，能够引起患者微血管渗漏、气道痉挛、气道高反应、分泌物增多、气道上皮细胞损伤等，此外还有遗传环境因素、神经机制等[4]。正常情况下，人体免疫细胞及各淋巴细胞亚群均处于一种平衡状态，当人体受到各种因素影响免疫状态失衡，则会产生肿瘤、炎症反应性疾病和自身免疫性疾病[5]。所以本次采取控制单一变量方法探讨细胞免疫应答变化与支气管哮喘疾病进展的相关性，为提高支气管哮喘治疗提供新的依据，现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2017年5月至2018年5月安阳地区医院和河南省人民医院接诊治疗的95例支气管哮喘患者为观察组，选取同期在安阳地区医院和河南省人民医院体检的健康人95例为对照组，本研究经安阳地区医院和河南省人民医院伦理委员会审理批准。两组对象临床资料差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 研究对象资料对比分析

1.2 纳入和排除标准 纳入标准：支气管哮喘患者[6]；未进行其他治疗；无精神病；未患有影响本次研究的脏器衰竭等疾病；同意参加本次研究。排除标准：中途退出研究者；诊断、治疗等病历资料不全者；过敏者；无法参与研究者；全身免疫系统疾病者。

1.3 研究方法 抽取两组研究对象空腹静脉血8 mL，使用上海知闵仪器设备有限公司生产的离心机离心，离心半径设置为15 cm，转速设置为3 000 r/min，分离血清，按照文献[7]的方法分离单个核细胞。按照文献[8]方法将处理过的单个核细胞标记辅助性T细胞1 (T helper cells 1，Th1)、Th2、Th17和调节性T细胞(regulatory cell，Treg)。然后将所有试管孵育20 min，避光，然后使用磷酸缓冲盐溶液洗涤2次，重悬后使用东芝医疗系统(中国)有限公司生产的流式细胞仪测定上述细胞比例。采用定量即时聚合酶链锁反应法检测研究对象外周血单个核细胞细胞因子mRNA表达情况：每孔细胞中加入浙江康德药业集团有限公司生产的TRIZOL裂解液，然后放置于冰上5 min，即可提取总RNA。提取总RNA 5 μg，在65℃条件下冰浴3 min，变性10 min，使用美岚实业(上海)有限公司生产的反转录试剂盒说明合成cDNA，-20℃保存。使用常州德烨化工有限公司生产的生物染料法荧光定量试剂盒以反转录得到的cDNA为模板，参照GAPDH，在94℃条件下预变性2 min，94℃条件下变性30 s，60℃条件下变性30 s，72℃条件下变性30 s，循环35个。使用2-ΔΔCt法计算白细胞介素-2(interleukin-2，IL-2)、IL-4、γ干扰素(interferon-γ，IFN-γ)、IL-10、IL-17、转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)、IL-22 mRNA的相对表达量，采用酶联免疫吸附法测定研究对象IL-2、IL-4、IFN-γ、IL-10、IL-17、TGF-β、IL-22蛋白表达水平，使用东芝医疗系统(中国)有限公司生产的流式细胞仪测定研究对象血液中CD3+、CD4+、CD8+水平，并计算CD4+/CD8+，所使用试剂盒均购自北京优尼康生物科技有限公司，操作步骤按照说明书进行。

1.4 统计学方法 采用SPSS 21.0统计软件，计数资料采用例数、比率表示，采用2检验，计量资料采用表示，采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 研究对象辅助性T细胞、调节性T细胞比例结果分析 观察组Treg和Th1细胞占比低于对照组，Th2和Th17细胞占比高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，观察组Th1/Th2低于对照组，Th17/Treg高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

2.2 两组对象免疫功能变化分析 观察组CD4+/CD8+、CD8+、CD3+和CD4+水平均低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

2.3 研究对象细胞因子mRNA表达结果分析 观察组TGF-β、IL-2和IFN-γ mRNA表达水平低于对照组，IL-22、IL-17、IL-4和IL-10 mRNA表达水平高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4、图1。

表2 研究对象辅助性T细胞、调节性T细胞比例结果分析

表3 两组对象免疫功能变化分析

表4 两组对象细胞因子mRNA表达结果分析

图1 研究对象细胞因子生物染料法荧光定量引物特异性检测图

2.4 研究对象细胞因子蛋白表达结果分析 观察组TGF-β、IL-2和IFN-γ 蛋白表达水平低于对照组，IL-22、IL-17、IL-4和IL-10 蛋白表达水平高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表5。

3 讨论

Th细胞、Treg 在人体免疫系统调节过程中具有重要作用[9-10]。Th1细胞能够分泌肿瘤坏死因子、IL-2、IFN-γ 等，能够调节巨噬细胞活性，诱导迟发型超敏反应的发生等[11]。Th2细胞能够分泌IL-5、IL-10和IL-4等，主要作用于体液免疫，在人体B细胞成熟过程中发挥重要作用[12-13]。正常情况下，人体Th1/Th2处于动态平衡状态，互相制约、但是一旦动态平衡遭到破坏，机体正常的免疫功能将受到破坏[14-15]。Th17细胞能够分泌IL-21、IL-22和IL-17等，能够调节人体自身的免疫应答以及部分抗感染免疫反应[16]。Treg细胞能够分泌IL-10、TGF-β等，在肿瘤免疫、自身免疫方面具有重要作用。Th17/Treg失去平衡将造成人体自身免疫性疾病、慢性炎症性疾病的发生[17]。Th细胞是T淋巴细胞主要亚群之一，可调控、协助体液免疫及细胞免疫应答，在慢性炎症反应中发挥重要作用，T细胞分泌的各种细胞因子在Th17/Treg和Th1/Th2的动态平衡过程中发挥重要作用[18]。支气管哮喘是由多种炎症因子参与的严重性气道炎症反应。细胞因子主要由人体免疫细胞分泌，能够在人体细胞间传递信息，主要功能是效应功能和免疫调节，其在提高人体免疫力、维持机体生理平衡、预防肿瘤、抵抗外援病原体侵袭等具有重要作用，一旦细胞因子表达异常则会引发人体肿瘤、休克、发热等症状。Th2细胞免疫过度反应造成Th1/Th2失衡是哮喘发病的免疫学基础。人体存在负反馈调节维持免疫系统Th1、Th2的平衡，IFN-γ可负向调节Th2的平衡，IL-4可负向调节Th1细胞。

表5 研究对象细胞因子蛋白表达结果分析

脑源性神经营养因子是一种促进神经生长的活性蛋白，可参与调控神经细胞生存、分化及凋亡，并与多种炎性反应有关，神经激肽A是分布于中枢神经系统中的一种重要神经递质，可促进气管平滑肌的收缩，调控炎性因子释放，本次研究发现，观察组Treg和Th1细胞占比低于对照组，观察组Th1/Th2低于对照组，IL-4和IL-10 mRNA和蛋白表达水平高于对照组，这说明支气管哮喘患者体内Th1/Th2失衡，可能是Th1向Th2发生部分转化造成的。部分研究提出，IL-4在哮喘疾病的发生、发展过程中发挥极其重要的作用，IFN-γ 则是一种十分有效的抗喘因子，同时IFN-γ和IL-4能够有效维持Th1/Th2的平衡。IL-4和IFN-γ又会促进Th1的分化，IL-4可以拮抗IFN-γ，能够调节Th2的分化，这些细胞因子的变化又加剧了Th1/Th2的失衡，这和部分研究人员研究结果基本一致[19-20]。研究同时发现，观察组Th17/Treg高于对照组，TGF-β表达水平下降，IL-22、IL-17表达上升，这说明患者体内Th17/Treg失衡。Th17分泌的促炎因子可引发人体内级联反应，促进Th17分化，抑制Treg细胞，同时抑制炎症因子IL-10和TGF-β水平下降，致使人体免疫能力下降。人体内成熟的T细胞主要有CD3+、CD4+、CD8+等，CD3代表总T细胞，CD4代表T辅助细胞，CD8代表T细胞毒性细胞。本次研究发现，观察组CD4+/CD8+、CD8+、CD3+和CD4+水平均低于对照组，这表明患者免疫能力与健康人群比较明显下降，这与部分人员的研究结果基本一致[21-22]。

综上所述，支气管哮喘患者CD4+/CD8+、Th17/Treg和Th1/Th2比值较健康人群发生变化，支气管哮喘疾病的进展可能与这些细胞免疫应答的异常变化密切相关。但是本次研究对象均从安阳地区医院和河南省人民医院抽取且均集中在较短时间段内，研究结果有局限性，尚需进一步研究。