哮喘相关生物标记物的研究进展*

徐敏,胡田勇,邱书奇,程保辉

深圳市龙岗区耳鼻咽喉医院耳鼻咽喉科、深圳市耳鼻咽喉研究所(广东深圳 518116)

近几十年来，随着哮喘患病率的逐年增加，针对哮喘的研究也深入到免疫病理和表型异质性等各方面，为结合临床达到准确诊疗的目的，我们需要对人、病、药进行精准认识并进行精确治疗[1]。根据美国国立卫生研究院(NIH)的研究报告，精准医疗是一种新兴的疾病治疗和预防措施，考虑到个体在基因、环境和生活方式上的差异，其实施需要统一的可测量指标，即生物标记物。机体内生物标记物形式各样，包括疾病病理生理过程中涉及的蛋白质、脂类、核酸、机体代谢物等[2-3]。根据之前的研究报道，我们已经了解到几种哮喘的标记物[如IgE、嗜酸性粒细胞、呼出气一氧化氮(fractional exhaled nitric oxide,FeNO)]，但它们在诊断、治疗和预后中的应用仍存在争议。生物标记物不仅可从分子水平探讨发病机制，而且在准确、敏感地评价早期、低水平的损害方面有着独特的优势，可提供早期预警，很大程度上为临床医生提供了辅助诊断的依据。因此，本文将针对哮喘的生物标记物在哮喘诊断、药物治疗、病情预后方面的研究进展作一综述。

1 外周血细胞类

哮喘患者的外周血嗜酸性粒细胞和中性粒细胞数量变化与患者的临床表现有关。Nadif等[4]根据哮喘患者外周循环中嗜酸性粒细胞和中性粒细胞计数，定义了4种哮喘炎症模式，包括嗜酸性粒细胞型、中性粒细胞型、无典型炎症细胞型和混合细胞型，不同的炎症模式显示了哮喘表型特征之间的显著差异，例如，嗜酸性粒细胞增多与哮喘症状频发相对应，中性粒细胞增多伴随着痰液的产生增多，嗜酸性粒细胞和中性粒细胞均增多的患者夜间症状更严重[5]。在哮喘患者中，有吸烟史和持续气流受限的患者中性粒细胞增多比不吸烟的患者更显著，Tommola等[6]对188例成人哮喘患者持续随访12年，随后进行再次评估发现，哮喘-慢性阻塞性肺疾病重叠综合征患者(asthma COPD overlap syndrome,ACOS)相对于无吸烟史的单纯哮喘患者肺扩张能力减弱、血中性粒细胞水平升高更明显(4.5×109·L-1vs3.6×109·L-1)、血IL-6水平增加(2.88 pg/mLvs1.52 pg/mL)。

外周血细胞计数也可作为气道炎症的替代标记物。支气管肺泡灌洗和支气管内活检是鉴别气道炎症类型及程度的参考标准，但这些检查具有侵入性、且费用昂贵，不利于作为哮喘患者的常规检查，临床诊断需要一种患者更易接受的快捷、非侵入性方法[7]。一项关于哮喘气道嗜酸性粒细胞增多症微创标记物研究的Meta分析结果显示，血嗜酸性粒细胞有预测气道嗜酸性粒细胞增多的能力，评估指标ROC曲线下面积(area under the curve，AUC)为0.78，提示结果有一定的准确性[8]。外周血Ⅱ型固有淋巴细胞(type 2 innate lymphoid cells，ILC2)计数在预测痰嗜酸性粒细胞增多方面也有类似的作用，Liu等[9]收集150例哮喘患者痰液以检测痰液中嗜酸性粒细胞数量，同时测定外周血淋巴细胞ILC2的比例、血嗜酸性粒细胞计数、总免疫球蛋白E(IgE)、FeNO浓度，结果经ROC分析显示，与气道嗜酸性粒细胞炎症关系最密切的因素为ILC2比例，其预测的敏感度为67.7%，特异度为95.3%，因此，ILC2可作为哮喘患者气道嗜酸性粒细胞炎症的替代标记物。然而，血中性粒细胞增多并不能代表痰中性粒细胞增多；Hastie等[10]对328名重度哮喘受试者进行血液、痰细胞、肺功能、FeNO和IgE检测，ROC曲线分析得出血中性粒细胞预测痰中性粒细胞的AUC值约为0.4，准确性较低。

一项初步研究发现哮喘患者与健康人群的外周血微小RNA(microRNA，miRNA)谱存在差异。Milger等[11]通过基因转化的方法，证明了血浆miRNA在哮喘患者中的表达与健康人相比存在差异，其数量变化与临床特征相关。miRNA参与哮喘发病机制的各个环节，在促炎和抗炎方面均有作用，可通过抑制IL-6、IL-8导致免疫功能紊乱，Let-7 miRNA调控IL-13，miRNA-155激活免疫细胞调控CD4+T细胞等，作用贯穿哮喘发病的全过程。miRNA具有高度的保守性和极强的稳定性，因此，血浆中的miRNA可被用作哮喘诊断性的生物标记物[12]。

血嗜酸性粒细胞计数对Th2型炎症的治疗有反应。对于抗IgE单克隆抗体奥马珠单抗的治疗，血嗜酸性粒细胞增多(≥300·μL-1)是对其反应良好的预测因子。Casale等[13]收集1 071例成人及青少年哮喘患者，在16周吸入糖皮质激素(inhaled corticosteroid，ICS)治疗的基础上随机抽取542例给予奥马珠单抗治疗，529例给予安慰剂连续治疗12周。期间分别记录血嗜酸性粒细胞≥200·μL-1、≥300·μL-1和≥400·μL-1患者的急性发作情况，结果显示随着血嗜酸性粒细胞计数的增加，奥马珠单抗的疗效越显著，急性发作缓解率增加，这表明奥马珠单抗的疗效在较高的血嗜酸性粒细胞水平下效果更好。抗IL-5单克隆抗体美泊利单抗与奥马珠单抗作用相似，对于高水平血嗜酸性粒细胞患者疗效更好[14-15]。

血嗜酸性粒细胞增多也可以监测和预测糖皮质激素治疗的效果。Fitzpatrick等[16]通过观察年龄在12～59个月、不同血嗜酸性粒细胞计数的儿童进行ICS治疗的反应，发现血嗜酸性粒细胞增多≥300·μL-1的患儿对ICS的反应性更好。而在服用口服糖皮质激素(oral corticosteroid，OCS)时控制血嗜酸性粒细胞在<200·μL-1的范围有助于预防哮喘急性发作、改善病情[17]，血嗜酸性粒细胞增多是患者气道受阻的危险因素，高血嗜酸性粒细胞与哮喘控制不良和病情恶化有关。Konradsen等[18]为评估持续性哮喘儿童的气道炎症情况收集96名不同表型的持续性哮喘学龄期儿童进行检测，比较高、低水平血嗜酸性粒细胞的儿童时，发现高水平的嗜酸性粒细胞与哮喘的严重程度、急性加重、FEV1/FVC和气道高反应性有显著的相关性，高水平血嗜酸性粒细胞的患儿哮喘发病率更高。Price等[19]将343 927例12～80岁的哮喘患者根据最初血嗜酸性粒细胞计数分为两组(血嗜酸性粒细胞>400·μL-1、≤400·μL-1)，并进行了连续两年的追踪观察，各项检测结果发现与血嗜酸性粒细胞≤400·μL-1的患者相比，高血嗜酸性粒细胞水平的患者急性发作的概率更大，急性发作的程度明显更严重，病情稳定性较差。另外，血中性粒细胞增多与哮喘气道感染、肺功能下降、症状控制不良和病情加重也具有一定联系[20-21]。

2 血清炎性介质类

血清中炎症介质与哮喘患者的气道炎症情况具有相关性。哮喘患者和健康人血清中几丁质酶样蛋白YKL-40存在明显差异。James等[22]收集了61例轻中度哮喘患者、76例重度哮喘患者与48例健康成人，通过ELISA法检测血清中YKL-40，健康成人、轻中度患者与重度患者血清中YKL-40浓度分别为23.0 ng/mL、33.3 ng/mL、43.3 ng/mL，提示哮喘患者血清中的YKL-40水平升高，升高趋势与疾病严重程度呈正相关。

哮喘患者血清骨膜蛋白水平与气道嗜酸性粒细胞计数呈正相关。骨膜蛋白在IL-4和IL-13的作用下表达上调并由气道上皮细胞释放并作用于嗜酸性粒细胞，促进后者在上皮下基膜中的黏附和运动，在嗜酸性粒细胞的迁移和运动过程中起着向导作用，而骨膜蛋白升高可通过规范的糖皮质激素治疗抑制[23]。Simpson等[24]收集83例经临床评估诊断为哮喘控制不良的成人患者痰液样本和血液样本，其中37例为嗜酸性粒细胞性哮喘，用免疫分析法检测血清中骨膜蛋白浓度，结果发现血清中骨膜蛋白水平与痰液中嗜酸性粒细胞比例显著相关，AUC值为0.829，但其数量变化与哮喘症状控制良好与否无关。与非嗜酸性粒细胞性哮喘相比，嗜酸性粒细胞性哮喘患者的血清和痰液中骨膜蛋白均明显增高[25]。

血清超敏C反应蛋白(hypersensitive c-reactive protein，hs-CRP)数量与痰液中嗜酸性粒细胞计数增多有关。hs-CRP在血清中较为稳定，在机体受到损伤后(病毒感染除外)由IL-6和TNF-α刺激产生，并且不受性别、年龄、妊娠、贫血等因素影响。张晓婷等[26]收集30例哮喘急性发作患者与14例健康成人进行实验，测量其血清hs-CRP和诱导痰白细胞分类计数，结果显示哮喘组血清hs-CRP与诱导痰嗜酸性粒细胞百分比呈正相关(r值为0.849)，血清hs-CRP相对于嗜酸性粒细胞百分比鉴别是否发生哮喘的敏感度及特异度略低(AUC值分别为0.713、0.794)。

尿激酶型纤溶酶原激活物受体(urokinase plasminogen activator receptor，uPAR)对诊断哮喘也有一定辅助作用。uPAR基因被认为是哮喘患者的敏感基因，该基因的多态性与肺功能有关。在哮喘患者和COPD患者中，可溶性裂解uPAR(soluble cleaved form of uPAR，scuPAR)被认为是一种预示疾病发病率和死亡率增加的标记物[27]。Portelli等[28]收集27例哮喘患者和9例健康成人，进行支气管活检并通过免疫组化法检测组织中uPAR浓度，另外通过ELISA法检测129例哮喘患者和39例健康成人血清scuPAR水平。两个研究分别发现在哮喘患者支气管组织固有层、支气管上皮和气道平滑肌细胞的炎症细胞中uPAR水平升高，但升高趋势与疾病严重程度或哮喘临床特征无相关性；哮喘患者血清中的scuPAR水平是正常组的1.5倍，并发现高水平的uPAR与严重的非遗传性过敏疾病之间存在关联，但其关联程度仍需要在以后的研究中进行深入探索。

高水平的血清骨膜蛋白可以预测对奥马珠单抗治疗的良好反应性。Tajiri等[29]收集了30名接受奥马珠单抗治疗至少1年的患者，其中27名治疗时间为2年，通过对比发现在治疗的第一年，最初血清骨膜蛋白水平和血嗜酸性粒细胞计数高的患者病情没有明显加重，而相对水平低的患者病情仍有不同程度的加重。在治疗16～32周后，游离血清IgE计数明显降低，同时患者急性发作的次数逐渐减少。

反复性气道炎症和炎症引起的气道结构重塑是长期哮喘的特征性表现，其可通过血清炎性介质进行检测。血清骨膜蛋白水平与气道炎症和气道重塑有密切联系，Takahashi等[30]收集235名病情控制良好的成人患者，对其进行血嗜酸性粒细胞、肺功能、FeNO和血清骨膜蛋白分析，结果显示哮喘患者的血嗜酸性粒细胞计数和血清骨膜蛋白水平均与FeNO水平升高有关，血清骨膜蛋白水平与FEV1/FVC比值(FEV1/FVC比值<70%)的关系较FeNO水平、血嗜酸性粒细胞计数和总IgE水平有更密切相关性。通过多因素分析显示气道高反应性、气流受阻与高血清骨膜蛋白水平(≥97 ng/mL)显著相关(比值比为3.2)。研究已证实血清骨膜蛋白在疾病进展过程中稳定性良好，可作为生物标记物应用于哮喘的长期监测[31]。血清总IgE计数与气道高反应性和支气管壁增厚有关[18]，梁彩艳[32]通过轻、中度哮喘患儿与缓解期患儿进行对比发现气道高反应性与IgE呈高度相关性。血清YKL-40与哮喘气道受阻及病情急性加重密切相关，可作为预示哮喘加重的生物标记物[33]。另外，YKL-40水平与支气管壁增厚有关，Konradsen等[34]收集了严重哮喘且药物耐受患儿34例，药物控制良好患儿39例，健康儿童27例，通过调查问卷了解其一般情况，ELISA法检测血清YKL-40，高分辨率CT了解支气管壁增厚情况，结果发现药物耐受患儿血清YKL-40明显高于药物控制良好及健康儿童，YKL-40水平与患者支气管壁增厚程度具有相关性(r=0.45)。

3 呼出气中介质

FeNO数量与哮喘患者嗜酸性粒细胞计数增多有关。Korevaar等[8]总结17项哮喘相关研究共3 216名患者的数据发现FeNO有助于嗜酸性粒细胞性哮喘的诊断，AUC指标为0.75，提示FeNO对嗜酸性粒细胞性哮喘的诊断有重要的辅助意义，并且FeNO在推断低浓度痰嗜酸性粒细胞时比IgE检测更精准。但是，FeNO因容易受到患者糖皮质激素治疗和吸烟状况等的干扰，在推断痰嗜酸性粒细胞增多方面的能力具有局限性。

呼出气中的挥发性有机化合物(volatile organic compounds，VOCs)可以通过多气体检测仪电子鼻(eNose)装置检测分析。哮喘的气道炎症(大多为Th2嗜酸性粒细胞性炎症)可促进支气管上皮细胞膜脂质结构中多不饱和脂肪酸降解、挥发性碳氢化合物形成，这些挥发性有机化合物进入血液，随后以不同的结构在呼气中排出，用样品袋收集患者的呼出气并通过eNose识别其主要成分，结果能达到诊断与鉴别诊断的目的[35-36]。Cavaleiro等[37]收集64例6～18岁哮喘患者呼出气，基于呼出气VOCs的冷凝液eNose层次分析能够对儿童哮喘做出诊断，诊断的准确性AUC值为0.81，准确度、敏感度和特异度均在68.6%～93.1%之间。Fens等[38]收集90例实验者，包括COPD组、哮喘组、未吸烟健康成人组和吸烟健康成人组，通过eNose对VOCs的主要成分分析能准确辨别出4组之间的差异。主要成分分析图表明，COPD和哮喘患者的主要成分存在明显的差异，由此可以把COPD患者和哮喘患者区分开，此鉴别的标准判别分析显示鉴别的准确度为96%。

在有气道高反应性的患者中，FeNO水平可预测ICS疗效。Price等[39]筛选出294例(18～80岁)有非特异性、持续性呼吸道症状(筛选前至少有6周咳嗽、喘息或慢性呼吸困难症状)但以前未诊断为哮喘的患者。经过2周测量患者的一般情况后进行4周的ICS治疗，发现高水平FeNO患者ICS治疗后症状缓解更明显，低水平FeNO患者对ICS治疗反应性差，因此低水平FeNO患者可以避免这种治疗。在指导治疗方面，相对于主要临床症状，依据FeNO水平调整的哮喘药物剂量更能有效降低哮喘恶化的频率，因此，此生物标记物对经常急性发作的成人最有用[40]。Kupczyk等[41]前瞻性研究93例重症哮喘患者和76例轻中度哮喘患者1年后发现，FeNO与气道阻塞和病情加重相关，FeNO>45 ppb合并吸烟史的患者病情加重的频率及风险更大。

4 诱导痰炎症介质

诱导痰技术是通过非侵入性方法利用高渗生理盐水等诱导患者产生足量的痰液，并对痰液中的嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、细胞因子、病毒和细菌等成分进行分析，以此判断疾病严重程度及预后[42-44]。然而，痰诱导过程需要耗费大量时间，并且需要经验丰富的操作人员，在收集方面也存在困难，许多患者无法产生足量的高质量样本，所以在临床的实用性较小。

痰嗜酸性粒细胞百分比增多≥3%可表示患者对ICS和美泊利单抗治疗的反应较好[45-46]，而低痰嗜酸性粒细胞百分比(<2%)患者对莫米他松或噻托溴铵的反应与安慰剂无较大差异[47]。痰嗜酸性粒细胞的改变反映哮喘临床症状控制的波动，其与哮喘严重程度呈正相关，与肺功能状况呈负相关[41,48-49]。人肿瘤坏死因子相关凋亡弱诱导因子(TNF-like weak inducer of apoptosis，TWEAK)与炎症的发病机制有关，Kim等[50]为证实其与哮喘的相关性，收集年龄在5～18岁之间的95例哮喘患儿和78例健康儿童进行肺功能检测和乙酰胆碱激发试验，收集痰液检测嗜酸性粒细胞和TWEAK，结果显示哮喘患儿的TWEAK明显高于健康儿童，并与气道阻塞、肺功能下降有密切联系，该特征在非嗜酸性粒细胞性哮喘中更明显。另外，其在痰液中的浓度与非嗜酸性粒细胞炎症严重程度(r=0.358)、症状控制情况(r=0.470)均有关。

5 尿代谢物

尿白三烯E4(leukotriene E4，LTE4)可以作为哮喘诊断的一个辅助因子。冯晓朦等[51]收集30例哮喘患儿和30例正常幼儿尿液通过ELISA检测对比LTE4含量，结果发现患儿LTE4含量明显高于正常幼儿[分别为(380.66±115.76)ng/mL、(263.52±46.21)ng/mL]。尿哮喘患者和COPD患者之间尿代谢物分析存在差异，核磁共振波谱(nuclear magnetic resonance，NMR)可以检测出尿液样本中的这种差异。Adamko等[52]收集54例哮喘患者和23例COPD患者的尿液样本进行NMR分析，在排除不相关代谢物后，对22种相关性高的代谢物进行分析，结果由变异系数图显示得出哮喘患者尿液中精氨酸、肌酸酐、谷氨酰胺、羟基乙酸等代谢物明显高于COPD患者，诊断的准确性高于90%，并且急性发作后的尿代谢物分析结果与此结果中检测出的代谢物大多数一致。

尿溴酪氨酸(bromotyrosine，BrTyr)与ICS反应性相关。Cowan等[46]收集46例年龄为18～75岁的患者，在其接受ICS治疗期间检测FeNO、痰嗜酸性粒细胞和尿BrTyr水平，结果发现经过28 d治疗后，82%的哮喘患者FeNO水平下降，60%患者痰嗜酸细胞计数下降，58%患者尿BrTyr水平下降。尿BrTyr具有监测ICS疗效的效用，并且其与FeNO水平联合监测的准确性进一步提高(13.3倍)。

6 小结

精准医疗在哮喘领域的潜力才刚刚开始被探索，针对疾病临床特征和改善患者生活质量的个体化治疗仍需要医学工作者们不断探究。精准医疗的实施，需要有效的生物标记物提供保障，一个有效的生物标记物从发现到临床应用，是一个相当漫长且消耗资源的过程，需要通过大量数据证实，以确保该生物标记物的实用性以及准确性。有效的生物标记物不仅要准确反映特异性疾病的机制，并且要以快速、简便、经济有效的方式进行量化。只有在这些前提下，生物标记物的研究才能影响临床实践，并转化为对哮喘患者的诊断、治疗和管理方面的提高。