幼鼠与成鼠卵巢组织学研究

马 越，郭桂兰，高燕程，王 楠，张 栋，李明娜

（甘肃农业大学 动物科学技术学院，甘肃 兰州 730070）

卵巢是雌性动物的性腺，通常左右成对存在于母畜的腹腔内。动物到达初情期后，在激素的调控下进入发情周期[1]。此后的卵巢周而复始地产生类固醇激素，排出卵子，形成黄体，从而使得母畜表现出周期性的发情状态[2]，以便饲养管理人员及时配种。母畜的生产性能主要表现在产仔、哺乳等与繁殖相关的活动中，然而卵巢的机能在很大程度上决定着母畜的生产性能[3]。具体来说，卵巢活动的正常与否决定着母畜性成熟的早晚、发情周期的长短、排卵数目的多少、卵子受精能力的高低、妊娠、分娩及哺乳能力的高低等多环节[4]。因此卵巢在雌性动物生产中扮演重要角色，研究卵巢的组织结构对了解其生理功能至关重要。

小鼠具有个体小、生长快、繁殖力强、饲养方便等特点，被广泛应用于药理学实验、疾病模型等方面的研究，尤其是胚胎生物学和胚胎工程方面的研究[5]。本研究基于模式动物小鼠，进行幼龄和成年小鼠卵巢组织形态学比较，旨在深入了解不同年龄卵巢中各级卵泡、黄体的形态差异，剖析卵巢生理功能，为后续家畜繁殖性能的研究提供理论参考依据。

1 材料与方法

1.1 实验小鼠

10只4周龄和10只8周龄成年SPF级KM白鼠（全雌），购自兰州兽医研究所。饲养于甘肃农业大学动物场，室温条件，自由饮食进水。3天无异常表现后用于后续试验。

1.2 试剂耗材

实验所用苏木精、伊红染液、中性树胶等均为索莱宝公司购买；载玻片、盖玻片自世泰实验器材公司购买；石蜡自上海华灵康复器械厂购买；刀片为德国莱卡；4%甲醛、无水乙醇、二甲苯等其他试剂购自国药集团。

1.3 常用仪器

本实验常用仪器有莱卡RM2235轮转式切片机、科迪 KD-TS3A自动脱水机、科迪KD-P摊片机、科迪KD-H烘片机、莱卡光学显微镜等。

1.4 实验步骤

1.4.1 取材与固定 饲养3 d后选取体重相近的4周龄小鼠（体重24.25±2.65 g）和8周龄小鼠（体重32.42±2.75 g）各6只。将所有小鼠做好标记，颈部脱臼处死。剪开皮肤，用镊子拉出小鼠左右两侧子宫和卵巢，用镊子及手术刀将卵巢与其他组织器官分割开并清除卵巢上的脂肪。后迅速将卵巢浸入4%甲醛溶液内固定，防止细胞死亡后自溶或细菌分解。

1.4.2 脱水与透明 将卵巢组织从固定液中取出，放在微水流中流水冲洗12 h。后用不同浓度酒精（从低到高）作为脱水剂，逐步脱去组织中的水分，再将组织置于二甲苯中透明，以二甲苯替换出组织中的酒精。具体溶液的浓度与时间见表1。

表1 脱水与透明所用溶液浓度及时间

1.4.3 浸蜡与包埋 将自动脱水机内的组织取出，按合适的方位置于模具中，缓慢倒入已经融化好的石蜡，放入熔蜡箱保温，待石蜡完全浸入组织后进行包埋。整个过程要求迅速稳当。

1.4.4 切片与贴片 将包埋好的蜡块固定于切片机上，切成厚度为5 um薄片。切下的薄片往往过于皱褶，需放在加热至25 ℃摊片机上摊平，再贴到载玻片上（注意不要产生气泡），后置于45℃的烘片机上烘干。

1.4.5 脱蜡与染色 本实验采用HE染色，先经2次二甲苯将切片上的石蜡脱尽，用吸水纸吸干液体。脱蜡后经不同梯度乙醇下行至流水；苏木精染液染色，后用蒸馏水洗掉多余的染料；入分化液（1%盐酸+99%乙醇）分色，分色后用蒸馏水洗；入0.5%伊红染液染色，后用80%酒精对伊红进行分色；再以梯度酒精脱水，二甲苯透明。其溶液的浓度与时间见表2。

表2 脱蜡与染色所用溶液浓度与时间

1.4.6 封片 用玻璃棒蘸取适量中性树胶于载玻片上，盖上盖玻片待凝固后观察结果。

1.5 数据分析

采用CaseViewer软件测量每个卵泡面积、数量、直径、含膜面积（三级至成熟卵泡）、膜厚（三级至成熟卵泡），及黄体面积、数量和直径。SPSS 18.0软件对数据进行独立样本T检验。GraphPad Prism 8作图。每组5个个体，数据以“平均值±标准差”方式表示。P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 小鼠卵巢的组织结构观察

在生物显微镜可以观察到细胞核为蓝紫色，细胞质、透明带、卵泡液、基膜、胶原纤维等被伊红染成不同程度的红色，卵巢的原始、初级、次级、三级、成熟等各期卵泡结构能清楚地观察到。

如图1A所示，原始卵泡排列在卵巢皮质外周，呈卵圆形，由中央的卵母细胞和外周呈扁平状的卵泡细胞构成；卵母细胞呈卵圆形，HE染色胞质呈红色，胞核呈蓝色，胞核大而圆位于卵母细胞中央。

如图1B所示，初级卵泡排列在卵巢皮质外周，体积略大于原始卵泡，外周卵泡细胞由扁平状发育为单层立方状细胞，此时卵泡膜尚未形成，同时也无卵泡腔。

随着卵泡的发育，初级卵泡移向卵巢皮质中央，形成次级卵泡（图1C）。单层立方状卵泡细胞增殖形成多层柱状细胞，此时的卵泡细胞称之为颗粒细胞；当卵母细胞被2～3层颗粒细胞包围时，于卵母细胞和卵泡细胞之间出现透明带，HE染色呈淡红色。

随着卵泡的进一步发育，颗粒细胞层数进一步增加，层数达到4～5层时，形成完整的透明带，HE染色呈红色；同时颗粒细胞层出现分离而形成不规则的腔隙，其间充满着由颗粒细胞分泌的卵泡液，各小腔隙进一步合并形成月牙形的卵泡腔，此时的卵泡称为三级卵泡（图1D）。此时卵泡直径增加明显，卵母细胞移位于卵泡的一侧，与周围的颗粒细胞共同形成卵丘，靠近透明带的颗粒细胞形成放射冠，卵泡膜分化为内外两层。随着三级卵泡的继续生长，卵泡腔增大，卵泡液增多，卵泡扩展到整个卵巢皮质部而突出于卵巢的表面，形成成熟卵泡。

图1E为黄体。卵泡排卵后，卵泡内膜细胞和颗粒细胞先形成红体，之后二者逐步黄体化形成颗粒黄体细胞和膜黄体细胞，随着黄体的进一步发育，颗粒黄体细胞体积增大呈椭圆形HE染色胞质呈红色，胞核呈浅蓝色；膜黄体细胞主要分布黄体的外周部。

图1F为闭锁卵泡。哺乳动物出生后，99%原始卵泡在发育过程中自发性退化，称为卵泡闭锁。

图1 各级卵泡形态

表3 各组小鼠卵巢中卵泡及黄体数量比较

2.2 幼鼠与成鼠卵泡与黄体数量、直径和面积比较

如表3所示，成鼠黄体数量极显著高于幼鼠，这是因为幼鼠还没有进入发情周期，没有黄体存在。有腔卵泡数，成鼠与幼鼠差异不显著。无腔卵泡数，成鼠极显著高于幼鼠组。

3 讨论

幼鼠与成鼠卵巢切片比较，结果显示幼鼠卵巢中没有黄体，但存在处于生长发育阶段的各级卵泡。成年卵巢中各级卵泡、黄体均存在，且无腔卵泡数量显著高于幼鼠。表明动物达到成年后，在完善的发情周期调控下，卵巢中的各级卵泡生长发育较幼鼠快，数量多，并且有正常排卵现象。切片中观察到，成年卵巢和幼年卵巢中成熟卵泡较少，表明所有小鼠没有处于将要排卵的阶段。另外，因成熟卵泡与三级卵泡没有明显的界线，因此在文章中没有分开做统计，综合统计为有腔卵泡的数量。结果发现成鼠组和幼鼠组有腔卵泡数差异不显著，这可能与实验样本量较少有关。今后的实验中有待进一步扩大样本量进行统计分析。

哺乳动物出生后，99%原始卵泡在发育过程中自发性退化称为卵泡闭锁[6],卵泡闭锁是毛细血管、上皮细胞、颗粒细胞、卵母细胞以及卵泡液中激素等组分系列变化的结果[7]。生长卵泡的闭锁存在两种不同形态，分别是实心卵泡和囊状卵泡，实心卵泡的颗粒层和卵泡膜都向内增生而占据整个卵泡腔；囊状卵泡的颗粒层和卵泡膜会萎缩，而卵泡腔内不发生变化。与健康卵泡相比，闭锁卵泡孕酮（P4）浓度较高而雌二醇（E2）浓度较低[8]；卵泡闭锁时，近腔颗粒细胞凋亡急剧增多并落入卵泡腔内，甚至卵丘卵母细胞复合体也逐渐脱落［6,9］。卵泡闭锁影响哺乳动物的繁殖性能，近年来越来越多的学者从分子遗传学角度来研究卵泡闭锁的原因。

4 结论

本研究初步对卵巢进行组织形态学分析，区分了不同发育阶段的卵泡和黄体，并明确了各自特征。比较发现幼鼠卵巢中没有黄体存在，成熟无腔卵泡数量显著高于幼鼠，有腔卵泡数量差异不明显。下一步将从各级卵泡面积、占卵巢总面积之比及各级卵泡超微结构入手深入挖掘幼龄和成年小鼠卵巢组织结构差异，为今后家畜繁殖性能的提高提供理论参考。