液质联用法同时检测动物源性食品中氯霉素和甲硝唑的探讨

张琳 李敏 张辰辰

氯霉素和甲硝唑都是在家畜养殖过程中经常会使用到的抗生素类药物，但是由于大多数家畜养殖密度较高，发病率也相对较高，养殖户为了降低发病率会大剂量使用此类抗生素，由此引发一系列食品安全问题，影响人体健康。因此，加强对动物源性食品中氯霉素和甲硝唑的检测研究是十分重要的，其中液相色谱-串联质谱法是当前较为有效的检测手段。

一、材料与方法

1.试剂。甲醇（色谱纯，美国Fisher公司）；无水硫酸钠、乙酸乙酯、甲酸、氨水、正己烷（分析纯，上海国药集团试剂有限公司）；氯霉素、甲硝唑混合标准溶液（100μg/mL，甲醇）；氯霉素氘代内标（氯霉素D5）标准溶液（100μg/mL，甲醇）。氯霉素、甲硝唑、氯霉素-D5混合基质标准工作溶液：将进行前处理和仪器定性未发现目标化合物峰的样品中，分别加入适量的氯霉素和甲硝唑混合标准溶液以及氯霉素-D5标准溶液，配制成0.5ng/mL、1.0ng/mL、2.5ng/mL、5ng/mL、25ng/mL，氯霉素D5浓度均为10ng/ml的混合基质标准工作溶液。

2.仪器分析条件。（1）仪器。Exion LC-triple quad 3500三重四极杆液相色谱质谱联用仪（美国sciex公司）；超声波清洗机；漩涡混合仪；高速冷冻离心机；全自动平行浓缩仪；超纯水机。（2）超高效液相色谱条件。色谱柱：Agilent-Eclipse plus C18柱（1.8μm，100mm×2.1mm），流速0.3mL/min，进样体积为10μl，柱温40℃。流动相及梯度洗脱程序：梯度洗脱；0-1min，10%B；1-5min，10%-100%B；5-6min，100%B；6-6.1min，100%-10%B；6.1-8min，10%B。（3）质谱条件。选用多反应监测模式（MRM），电喷雾离子源（ESI）正负离子同时扫描模式。电喷雾电压：-4500V/5500V；雾化器气压力：0.345MPa；气帘气压力：0.069MPa；辅助气流速：0.345MPa；离子源温度：550℃。

3.样品。对济宁市任城区4处大型超市及3处农贸市场进行采样，共20份样品，包括猪肉、牛肉、鸡肉、鸭肉、猪肝、鸡肝、淡水鱼、虾等。

4.样品提取。样品通过粉碎机打碎成泥，冷藏待用。称取5.00g样品，加入10μL（1000ng/mL）的氯霉素D5、10mL乙酸乙酯、0.45mL氨水和5g无水硫酸钠，涡旋30s混匀，超声提取5min，10000r/min条件下离心5min，转移上清液至另一离心管中。重复提取一次，合并两次上清液，备用。取备用液，40℃氮气吹干，用1mL甲醇-水（50︰50，V︰V）溶解残渣，再加入3mL正己烷，涡旋3min，静置分层，弃去正己烷层，重复此步骤3次。溶液用0.22μm的滤膜过滤，待测。

二、结果与讨论

1.实验条件的优化。为进一步优化实验效果，确保实验结果准确可靠，本实验在国标的基础上进行了一定程度的优化和改进。（1）样品提取条件。本研究方法简化了国标实验步骤，对样品提取条件进行了合理优化，使用乙酸乙酯进行样品提取，在氮吹后使用甲醇-水（50︰50，V︰V）进行溶解，依旧采用正己烷除去油脂，并经过滤膜过滤后进行测定。与国标中的检测方法相比，这种样品提取方式更加简单，并且回收率较高。特别是在以内脏为样品进行实验的过程中，采用甲醇-水（50︰50，V︰V）对其进行溶解时能够得到澄清溶液，达到溶解残渣的目的。（2）仪器方法。本实验参考了标准方法中较为成熟的梯度洗脱程序和质谱各项参数设置，并在此基础上对部分参数进行了优化。实验发现，使用1%甲酸水溶液和甲醇作为流动相时，氯霉素和甲硝唑能保持足够分离度和良好峰形。质谱条件的优化结果见表1。

2.方法学验证。本研究对设计的实验方法进行了验证，包括线性范围及相关系数、定量限，采用10倍信噪比对应的浓度作为方法定量限（LOQ）。经验证，氯霉素、甲硝唑的方法定量限分别为0.1ug/kg和0.5ug/kg，线性范围为0.1-5μg/kg，相關系数R2分别为0.999、0.998；分别选择3个浓度进行加标回收测试（n=3），加标回收率在78.0%-92.4%范围内，RSD不高于4.8%。检测结果详见表2。

3.样品实际测定。采用本研究优化后的方法对20份样品进行测定，每个样品进行2次平行独立测定，均未发现阳性样品（含量低于方法定量）。本研究方法在对氯霉素和甲硝唑共同测试过程中，相比于标准方法体现出更快速、高效的特点，并且获得了更优的离子流图。

食品安全关乎着人们的身体健康和生命安全，当前我国对于食品安全方面的检测和监督手段以及力度都在不断加强，我们对于动物源性食品方面的检测研究也从未停止。本方法对传统国标检测方法进行了优化和更新，实现了对动物源性食品中两种经常出现的抗生素进行同时检测，既弥补了传统国标抗生素检测方法中无法对这两种不同类抗生素进行同时检测的情况，还对国标检测方法进行了简化和改进，不仅降低了检测的难度，提高了实验的效率和简便性，还进一步提高了检测结果的准确度，较为适合推广应用。