黔东南州红心猕猴桃叶尖干枯病病原鉴定

张国辉，李向阳，顾焕先，张文华，佀胜利，李荣玉，李 明

（1凯里学院大健康学院，贵州凯里556011；2贵州大学作物保护研究所，贵阳550025；3凯里市林业局森林植物防治检疫站，贵州凯里556000）

0 引言

红心猕猴桃属中华猕猴桃中的红肉猕猴桃变种，是早熟红心品种和药食两用的珍稀品种，对人体有补血养颜和排毒防癌等的保健功效，对Vc缺乏症、高血压、心脑血管病和癌症等有辅助疗效[1-5]。红心猕猴桃已成为贵州省黔东南州农民增收的支柱产业，但果农缺乏对猕猴桃病害知识和科学防控技术的了解，导致部分地区的果园病害日趋严重，影响了当地猕猴桃产业的健康发展。1998年，黄亚军和戚佩坤首次采用常规分离病组织的手段对广东省猕猴桃根腐病进行了报道[6]，此后陆续报道有猕猴桃褐斑病[7-11]、炭疽病[12-15]、黑斑病[16]、黄化病[17-20]、细菌性叶枯病[21-24]、软腐病[25-26]和根结线虫病[27-30]等真菌病害，其中褐斑病、炭疽病、细菌性叶枯病、黑班病和黄化病均为叶部病害，是已报道的病害占比最多的。目前，国内外尚无红心猕猴桃叶尖干枯病的研究报道，此病害对红心猕猴桃的危害远大于其他叶部病害的危害，严重者可导致整株死亡。笔者针对红心猕猴桃叶尖干枯病的发病症状和病原鉴定进行研究，采集标本并进行室内病原分析，以期为红心猕猴桃病害进行补充并为后期的病害防治提供支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 病害标本 2019年10月—2020年5月在贵州省黔东南苗族侗族自治州黄平县岑花村半坡组的红心猕猴桃种植基地采集病株，并记录该病害的发生症状。采集新鲜标本于凯里市林业局检验检疫站用于病原菌的分离和鉴定。

1.1.2 供试培养基 PSA培养基。马铃薯削皮切块，称取200 g，1000 mL沸水中煮20 min，过滤加入蔗糖15 g，琼脂粉17 g，加水补足1000 mL，分装三角瓶，放于高压蒸汽灭菌锅灭菌20～30 min。

1.1.3 仪器与试剂 高压蒸汽灭菌锅、恒温培养箱、显微镜、超净工作台、移植针、剪刀、镊子、电磁炉、微波炉等。75%乙醇、0.1%升汞溶液、无菌水和工业酒精。

1.2 试验方法

1.2.1 症状的观察和描述 观察并描述红心猕猴桃发病部位的病斑形态、颜色和发病部位及危害程度等，同时对发病部位进行拍照。

1.2.2 病原菌的分离纯化和病原鉴定 采用组织分离法对红心猕猴桃的病叶和病茎进行组织分离，即用剪刀剪取病组织3块，在0.1%升汞溶液中浸泡2～3 min，然后放于75%乙醇浸泡2～3 s，再用无菌水漂洗3次，最后用镊子夹取漂洗好的病组织呈“品”字形放于PSA固体培养基中，并将平板倒置于恒温培养箱中25℃培养5～7天。用移植针对长成的菌落进行2次纯化，直至获得纯培养为止。当纯化后的菌落长满培养基，取菌落中央部分的菌丝挑取一点放于载玻片上，在显微镜下进行对病原菌的典型形态特征进行镜检拍照，同时对孢子大小和菌丝进行观察、测量和记录。

采用核糖体rDNA-ITS(Internal transcribed spacer)区序列分析法进行DNA测序，将ITS区序列测序结果经GenBank数据库BLAST比对，使用MEGA 4.0软件构建分子进化树，最后结合形态学观察结果对致病菌进行分类鉴定。

1.3 病原回接

将纯化后的病原真菌先在PSA培养基上培养5～7天，用无菌水反洗下的孢子液配制成浓度为106个/mL的菌悬液，采用针刺法和喷雾法在红心猕猴桃的新鲜叶片进行菌悬液接种。待叶片产生典型病斑后，根据柯赫氏法则，再采用组织分离法对病斑进行分离和纯化，最后将分离到的病原菌进行鉴定。

2 结果与分析

2.1 症状的观察和描述

红心猕猴桃的病叶发病初期，首先在叶尖正面出现暗褐色变色干枯，后期随着病害的加重和蔓延，叶尖病斑向叶柄方向大面积扩散，病部呈现大面积的深褐色干枯状坏死，发病部位的病健组织交界处明显，病斑边缘多为不规则形。猕猴桃叶片发病后期严重时，病斑可横跨叶脉，2/3的叶片呈大面积褐色坏死斑，叶片正面呈焦枯卷曲状（图1a）。红心猕猴桃发病叶片的背面呈深灰褐色，叶脉呈暗褐色，病健交界处明显，叶片卷曲和皱缩明显（图1b）。且病叶所在的技条外观正常，但轻折易断，肉眼可见折断的茎内呈现清晰的环形褐变，即发生维管束褐变（图1c）。

2.2 病原菌的分离纯化和病原鉴定

在PSA培养基上25℃培养7天后，边缘规则圆形，菌丝灰色，毡状，菌落中心有白色和橘红色圆形小突起（图1d）。病原菌可产生2种孢子，厚垣孢子为串生或单生，无色，大小为(6.98～20.45)μm×(5.38～18.26)μm（图1e）；分生孢子呈长椭圆形或长卵圆形，单胞，无色，大小为(0.9～2.9)μm×(0.9～1.2)μm（图1f）。采用形态学观察及核糖体rDNA-ITS(internal transcribed spacer)区序列分析法进行鉴定。对ITS区序列测序结果经GenBank数据库BLAST比对，结合分子进化树的构建结果（图2），菌株与Epicoccum sorghinum聚为一类（图2），确定该致病菌为高粱附球菌(Epicoccum sorghinum)。鉴于高粱附球菌(E.sorghinum)可导致植物枝枯和叶斑等症状，结合红心猕猴桃的发病特点，暂将其命名红心猕猴桃叶尖干枯病。

图1 红心猕猴桃叶尖干枯病的病叶和病原菌

图2 红心猕猴桃叶尖干枯病的病原菌的分子进化树

2.3 病原回接

根据柯赫氏法则，将配制好的孢子悬浮液经针刺法接种于红心猕猴桃的叶片上，3他后，红心猕猴桃的叶片开始发病长出病斑，4天后病斑布满全叶，病叶深褐色，呈干枯皱缩状（图3）。采用组织分离法分离病斑上的病原菌并进行显微鉴定，结果表明再次分离的菌株与接种的病原菌菌株相同，由此可以证明接种菌株为红心猕猴桃叶尖干枯病的致病菌。

图3 病原菌高粱附球菌回接发病症状

3 结论与讨论

贵州省黔东南苗族侗族自治州的红心猕猴桃产业对当地的经济发展和农民创收有重要作用，为减少经济损失，特对产区当前发生重要病害进行病害调查，结果表明由病原菌高粱附球菌(Epicoccum sorghinum)导致的红心猕猴桃叶尖干枯病的发病症状严重，为国内首次报道。

本研究结果表明，贵州省黔东南州黄平县岑花村半坡组的红心猕猴桃种植基地叶尖干枯病的发病症状较严重，可导致叶片的大面积枯死，并在茎杆处产生维管束的褐变现象。其病原菌为高粱附球菌属于附球菌属(Epicoccum)真菌，可引起多种作物的茎枯、枝枯和果腐等症状，因此严重地影响了受害植物的生长和发育[31]。至于叶尖干枯病的病原菌报道，已往的研究报道多为茎点霉(Phoma lilii)[32]、葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)[33]和叶点霉(Phyllosticta oryzicola)[34]，而在本研究中并未分离到以上这3类病原菌，只分离到高粱附球菌(Epicoccum sorghinum)，并采用了形态学显微镜检鉴定结合分子生物学的鉴定方法。目前，国内外关于高粱附球菌的报道很少。现有资料表明，高粱附球菌既可以作为病原菌危害作物，又可以作为内生菌具有抑菌活性[35]。附球菌属是小双腔菌科(Didymellaceae)的一类重要的植物病原真菌[36-37]，可侵染经济作物、农作物、林木、杂草等[38-39]，引起多种作物如皇竹草[40]、火龙果[41]、苹果[42]、越橘[43]等的茎枯、基腐、叶斑、枝枯、果腐等症状，可严重影响被侵染植物的生长和发育[44]。本研究未进行防控试验，但曾慧兰等[31]曾详细研究报道由E.sorghinum导致的百合叶尖干枯病，并提出啶酰菌胺对E.sorghinum的抑制作用最强，考虑到高粱附球菌对红心猕猴桃植株产生致命危害，可把啶酰菌胺用于红心猕猴桃叶尖干枯病的防控药剂备选。