采用连续监测法建立郑州地区健康成年人血清脂蛋白相关磷脂酶A2活性参考区间

毋小玉，崔发财，郑培明，刘艳红，李刚

（河南省人民医院检验科，河南 郑州450003）

脂蛋白相关磷脂酶A2（lipoprotein-associated phospholipase A2，Lp-PLA2）属于磷脂酶超家族成员之一,由单核-巨噬细胞和T淋巴细胞分泌，通过与高密度脂蛋白或低密度脂蛋白颗粒相结合的形式释放进入循环系统[1]。研究发现，Lp-PLA2可发挥其酶活性水解动脉壁内形成的氧化型低密度脂蛋白,生成溶血卵磷脂和氧化型游离脂肪酸两种炎症介质,后二者刺激细胞因子和粘附因子的表达并促进内皮细胞功能障碍、内皮细胞死亡及斑块内坏死核形成等多种动脉粥样化效应[2]。血清Lp-PLA2活性升高与血管内壁炎症反应和氧化应激相关,后二者是促进斑块进展和不稳定性并导致心脑血管事件发生的重要因素,因此监测Lp-PLA2活性水平变化有助于临床了解患者心脑血管疾病的发病风险,以便及时采取有效的干预措施[3,4]。此外,在糖尿病肾病[5]、糖尿病视网膜病变[6]、胆结石伴胆囊炎[7]及多发性硬化症[8]等以炎症病变为基础的疾病中也发现血清Lp-PLA2活性升高并成为这些疾病发生的风险因素。我国目前已取得注册资格并用于Lp-PLA2活性检测的试剂厂家不多,但参考范围存在差异,这给临床预估心脑血管疾病风险造成一定困扰。本研究参考美国临床实验室标准化协会(clinical and laboratory standards institute,CLSI)C28-A3文件及我国卫生行业标准WS/T 402-2012《临床实验室检验项目参考区间的制定》文件的相关要求，采用连续监测法检测郑州地区体检健康成年人血清Lp-PLA2酶活性值，并初步确立适合本实验室的参考区间。

1 材料和方法

1.1 研究对象 随机选取2020年3月至5月在河南省人民医院特需中心体检健康者600名,其中男性300名,女性300名，年龄18~76岁。研究对象按照年龄进行分组，分别为18~29岁118例，男性42例、女性76例；30~39岁132例，男性66例、女性66例；40~49岁120例,男性62例、女性58例；50~59岁116例，男性66例、女性50例；60岁以上组114例，男性64例、女性50例。

1.2 纳入标准 研究对象的纳入标准为：血压正常,18.5<体脂指数（BMI）<23.9，肝肾功能指标正常，心肌损伤标志物指标正常，血清胆固醇<5.17mmol/L（200mg/dl），血清甘油三酯<1.7mmol/L（150mg/dl），血清低密度脂蛋白胆固醇<3.1mmol/L（200mg/dl），血清肿瘤标志物指标正常，传染病相关抗原、抗体检测结果正常，血常规、尿常规正常，胸部X线摄影或胸部CT、心电图及B超检查均无异常表现。无糖尿病史，未患有心脑血管疾病、无重要脏器功能障碍、未患有肿瘤疾病、无家族遗传病史，无慢性病史，近期未服用降血脂或降血压药物。

1.3 仪器及主要试剂SIEMENS ADVIA2400全自动生化分析仪（德国西门子公司），血清Lp-PLA2活性检测试剂盒（连续监测法），血清Lp-PLA2校准品和质控品（宁波美康生物科技股份有限公司）。

1.4 标本采集及检测 采集禁食（≥8h）受试者早上6点至8点时间段的静脉血3 ml，30 min内离心（3500r/min，5min）并分离血清,保存于-80℃超低温冰箱。样本检测前应首先采用血清Lp-PLA2活性试剂盒配套的校准品进行项目校准,并进行Lp-PLA2质控品检测,质控结果在控后方可开展样本检测工作。检测原理：血液样本中的Lp-PLA2水解特异性底物1-豆蔻酰基-2-（4-硝基苯基琥珀酰基）-sn-丙三基-3-磷酸胆碱的sn位点,生成4硝基苯基琥珀酸,其在水溶液中降解后生成的对硝基酚可在生化分析仪光学系统进行检测,通过特定波长下吸光度的变化计算出脂蛋白相关磷脂酶A2的活性。

1.5 统计学分析 采用狄克逊（Dixon）检验法剔除原始数据中的离群值，有效数据采用SPSS17.0统计学软件进行分析，采用K-S检验判断各组数据是否呈正态分布，计量资料采用±s表示。两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析。分别计算Z值和Z*值并进行比较,确定血清脂蛋白相关磷脂酶A2活性参考区间是否需要按性别分组。采用百分位数法计算95%参考区间。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 正态性检验 将所有检测数据从小到大排列后计算全距（R）为702.4，两个相邻最大值间差值与两个相邻最小值间差值的绝对值分别为164.6和5.8，均小于临界值，表明600个观测值均为有效数据。K-S检验结果显示，健康成年人血清Lp-PLA2活性水平服从正态分布（Z=0.725，P=0.669）；不同性别间血清Lp-PLA2活性水平服从正态分布（男性：Z=0.749，P=0.629；女性：Z=0.582，P=0.887）；不同年龄段间血清Lp-PLA2活性水平服从正态分布（18~29岁：Z=0.690,P=0.727；30~39岁：Z=0.675，P=0.753；40~49岁：Z=0.763，P=0.605；50~59岁：Z=0.431，P=0.992；大于60岁：Z=0.474，P=0.978）。

2.2 血清Lp-PLA2活性水平组间比较 男性血清Lp-PLA2活性值为407±109U/L，显著高于女性（343±87U/L，t=5.661，P<0.01），见表1。Z检验结果显示Z=5.66>Z*=3.33，需单独建立男女性健康成年人血清Lp-PLA2活性参考区间。单因素方差分析结果显示,男性各年龄组间酶活性水平无显著差异（F=1.286，P=0.278），女性各年龄组间酶活性水平有显著差异（F=2.480，P=0.047）。LSD检验进一步分析显示18~29岁年龄组与30~39岁年龄组间酶活性水平无显著差异（P>0.05），40岁以上3个年龄组间酶活性水平无显著差异（P>0.05），而40岁以下两个年龄组分别与40岁以上三个年龄组之间酶活性水平差异显著（均P<0.01）。将女性合并为<40岁组和≥40岁组后，女性<40岁组血清Lp-PLA2活性水平显著低于≥40岁组(317±79U/L vs 361±88U/L，t=3.145，P<0.01)，见表2。

表1 不同性别组间健康成年人血清Lp-PLA2活性比较（±s）

表1 不同性别组间健康成年人血清Lp-PLA2活性比较（±s）

注：与男性组比较，**P<0.01

性别 例数男女合计300 300 600年龄（岁） Lp-PLA2(U/L)45（18~75）42（18~76）44（18~76）407±109 343±87**375±103

2.3 血清Lp-PLA2活性参考区间的建立 以百分位数法（P2.5~P97.5）建立健康成年人血清Lp-PLA2活性参考区间,男性为189~629U/L,女性为160~479U/L（18~39岁）,165~515U/L（40~76岁）,见表3。

3 讨论

心脑血管疾病（cardiovascular and cerebrovascular diseases，CCVDs）目前仍是导致我国人群死亡的首要病因，近年来随着生活压力增加、饮食习惯改变、环境污染等因素的影响，该疾病的患病率和死亡率呈逐年增加趋势[9,10]。研究表明动脉粥样硬化是心脑血管疾病的主要致病机制，而炎症反应在动脉粥样硬化形成过程中起着本质作用[11]。Lp-PLA2是一种新型的血管特异性炎症反应标志物，其参与了动脉粥样斑块形成的发生、发展、不稳定性及破裂的各个阶段，相较于传统的炎症标志物C-反应蛋白、肿瘤坏死因子和白细胞介素等，Lp-PLA2具有早期识别、高特异性和检测简便的特点[12]，我国于2015年颁布了《脂蛋白相关憐脂酶A2临床应用中国专家建议》推荐将Lp-PLA2检测用于冠心病及缺血性脑卒中的危险预测[13]。此外，在急性脑出血、缺血性中风、急性冠状动脉综合征等心脑血管疾病的预后研究中也发现Lp-PLA2活性升高的患者术后死亡和再住院风险增加,是判断预后是否良好的重要生物标志物[14,15]。

表2 不同年龄组间健康成年人血清Lp-PLA2活性比较（±s）

表2 不同年龄组间健康成年人血清Lp-PLA2活性比较（±s）

注：与女性组18~29岁比较，*P<0.05；与女性组30~39岁比较，#P<0.05；与女性组18~39岁比较，**P<0.01

性别 年龄（岁）男女18~29 30~39 40~49 50~59>60 18~29 30~39 40~49 50~59>60 18~39 40~76例数 Lp-PLA2(U/L)42 66 62 66 64 76 66 58 50 50 126 174 397±115 432±102 377±110 401±104 423±113 315±68 322±94 357±108*#364±85*#363±71*#317±79 361±88**

表3 百分位数法建立血清Lp-PLA2活性参考区间

表4 健康成年人血清Lp-PLA2活性参考区间的地区差异

建立待测指标的参考区间是正确解释检验结果、提供临床诊断或辅助诊断价值及反馈治疗效果的前提。由于纳入研究的生物个体间存在性别、年龄、种族、居住地、生活习惯等因素的差异，采用同一检测原理的不同试剂生产厂家所提供的参考范围存在差异,我国合格评定认可委员会（C-NAS）认可指南中明确建议各医学检验机构应建立适合本地区特征的项目参考范围。本研究中我们使用宁波美康公司生产的脂蛋白磷脂酶A2检测试剂盒结合西门子全自动生化分析仪构成的分析系统,采用连续检测法随机检测郑州地区600例健康成年人血清Lp-PLA2酶活性水平及其在不同性别及年龄组间的表达差异,并初步建立了适合本地区的人群的生物参考区间。

我们的研究结果显示,男性健康成年人血清Lp-PLA2活性水平显著高于女性,并且在女性不同年龄段中存在差异表达，高年龄人群中该酶表达活性有升高趋势，这与Donato LJ等[16]人的研究结果相一致。《中国心血管病报告2018》[17]指出，男性心脑血管疾病发病率远高于女性,且在心脑血管疾病的发病危险因素如肥胖、高血压、血脂异常、糖尿病等疾病中也呈现出男性发病率高于女性的趋势,而血清Lp-PLA2活性的性别间差异可能与男性心脑血管疾病发病率高有关。我国目前已建立血清Lp-PLA2活性参考区间的地区有上海[18]、长沙[19]和杭州[20]，三个地区研究结果均指出血清Lp-PLA2活性存在性别差异和女性年龄亚组间差异,这与我们的研究结果相一致。不同之处在于，郑州地区表观健康人群的血清Lp-PLA2活性整体偏低，此外，在女性参考区间年龄截点上，我们的研究结果与长沙地区相同，不同于上海和杭州地区,见表4。郑州地区属于我国北方城市，与其他三个地区存在明显的气候环境与饮食结构差异，这可能是血清Lp-PLA2活性与其他地区存在差异的主要原因,另外使用不同厂家提供的血清Lp-PLA2活性检测试剂盒和纳入调查研究的样本量少也是造成研究结果存在差异性的可能性因素。

综上所述,本研究调查了郑州地区健康成年人血清Lp-PLA2活性,初步建立了适合本地区人群的血清Lp-PLA2活性参考区间,有助于临床判断血清Lp-PLA2活性动态变化是否具有临床意义，以便及时采取有效的干预手段来降低心脑血管疾病的发生率和死亡率。