色谱指纹图谱在中药提取物及其牙膏质量控制中的应用研究

李 平 陈敏珊 陶 丽 肖俊芳

(广州薇美姿实业有限公司,广东 广州 510665)

1 引言

近年来，具有宣称添加中药、草本成分的口腔护理产品越来越受到消费者的欢迎。然而，对于生产厂家来说，中药提取物原料的质量控制一直是一个重点问题，也是难点问题。中药提取物质量控制的关键点在于保证其功效，因此需要对提取物的各组分和含量进行监控。中药材的种类繁多，成分复杂，产地分散，类同品、代用品不断，加之生长环境、采收季节、加工炮制方法不同及制剂生产工艺的因素，造成其内在质量即所含化学成分及临床疗效的差异。中药是依靠其所含的多种化学成分发挥综合的作用，这是与化学合成药最根本的区别。因此，模仿化学药品的质量控制模式，选定一两个有效成分、活性成分或指标成分进行鉴别和含量测定，不能有效地评价中药的真伪优劣。因为中药是多成分、多靶点在起作用，不同于化学药品的单一成分、单一靶点，这是中药与化学合成药品质量标准的根本区别[1,2]。

在建立中药质量标准体系的过程中，应充分考虑到中药的特性，结合系统论和控制论的理论，进行综合评价。中药指纹图谱技术是一个非常合理的切入点。中药指纹图谱是目前国际上认可的一种中药质量评价模式，它也是符合中药整体性使用特点的质量控制手段。国家食品药品监督管理局已在中药注射剂领域开始实施指纹图谱研究，对中药注射剂的药材、中间体和成药要求推广执行指纹图谱质量控制模式[3,4]。本研究以救必应提取物为例探讨色谱指纹图谱在中药提取物质量控制中的应用。

2 材料和方法

2.1材料与试剂

本实验所用救必应提取物由供应商采购不同产地救必应药材，使用统一的提取工艺提取所得，所有药材均为铁冬青干燥树皮。

紫丁香苷对照品(纯度99.9%)、长梗冬青苷对照品(纯度89.3%)(中国食品药品检定研究院)；色谱纯甲醇(TEDIA，USA)；色谱纯乙腈(TEDIA，USA)；

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ATCC6538)、大肠埃希氏菌(Escherichia coli ATCC25922)、牙龈卟啉单包菌(Porphyromonasgingivalis ATCC33277)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus AS1.2686)、变异链球菌(Streptococcus mutans ATCC700610)，均购自于广东省微生物研究所。

斜面培养基：

需氧细菌：胰蛋白胨大豆琼脂培养基(TSA)，厌氧细菌：脑心浸液琼脂培养基(BHA)；

实验培养基：

需氧细菌：胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB)，厌氧细菌：脑心浸液肉汤培养基(BHIB)。

2.2仪器与设备

ACQUITY UPLC H-class超高效液相色谱系统(TUV检测器，Empower3色谱软件)(Waters，USA)；超声波清洗机(SB-4200DT，宁波新芝生物科技股份有限公司)；超纯水器(UPC-I-5T，四川优普超纯科技有限公司)；分析天平(AR224CN，Ohaus，USA)；离心机(UNIVERSAL320，Hettich，Germany)。

生物安全柜(HR40-II-A2，青岛海尔特种电器有限公司)、立式压力蒸汽灭菌锅(LT-CPS38D，立德泰勀(上海)科学仪器有限公司)、微量移液器(Eppendorf，Germany)、漩涡混合器(JXW-80A，郑州南北仪器设备有限公司)、恒温培养箱(SPX-100B-Z，上海博迅实业有限公司)、96孔细胞培养板(Cellstar，Greiner，Germany)、酶标仪(RT2100-C，深圳雷杜生命科学股份有限公司)、厌氧/微需氧培养系统(LAB JAR，广州雷得生物技术有限公司)。

2.3方法

2.3.1色谱条件

色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18(2.1mm×100mm，1.7μm)；流动性A：超纯水；流动性B：乙腈；梯度洗脱程序见表1；流速：0.3mL/min；检测波长：210nm；进样量：1μL；理论塔板数以紫丁香苷峰计算不应低于3000。

表1 流动相梯度洗脱条件

2.3.2对照品溶液的制备

精确称取紫丁香苷和长梗冬青苷对照品适量，置于10mL棕色容量瓶中，使用50%甲醇溶液溶解、定容，制得含0.1g/L紫丁香苷和0.3g/L长梗冬青苷的溶液，使用0.22μm有机系微孔滤膜过滤，备用。

2.3.3供试品溶液的制备

精密称取救必应提取物0.1000g，置于50mL具塞锥形瓶中，加入25mL50%甲醇溶液，称重。超声提取30min(40KHz，400W)，再次称重，用50%甲醇溶液补足失重。10000g离心5min，取上清液过0.22μm有机系微孔滤膜备用。

2.3.4样品测定

按2.3.3条件制备不同产地来源救必应提取物溶液，按2.3.1色谱条件进行测定，记录色谱图。

2.3.5最小抑菌浓度(MIC)测定

参考美国临床和实验室标准协会(CLSI)颁布的抗微生物药物敏感性试验操作方法和判断标准(第9版)[5]，对各抗菌剂及牙膏产品进行最小抑菌浓度测定。厌氧菌采用厌氧罐进行培养。

3 结果与讨论

3.1精密度实验

取救必应提取物样品(IRC-1)供试液，连续进样6次，相似度结果均在0.99以上，各色谱峰峰面积的RSD值小于2.0%。

3.2稳定性实验

取救必应提取物样品(IRC-1)供试液，分别在0、2、4、8、12、24h按2.3.1色谱条件进行测定，各主要色谱峰保留时间RSD<1.0%，峰面积RSD<2.0%。结果表明，救必应提取物供试液在室温条件24h内稳定。

3.3重复性实验

2) 对景手法在突出所对主景的同时将物质空间与民众生活紧密相连，营造出场所感与归属感，吸引人们用脚步丈量、感知城市，也为民众在公共空间驻足、交往提供了可能，城市生活因此而充满生机与活力.

精密称取同一救必应提取物样品(IRC-1)6份，按2.3.3方法制备供试液，按2.3.1色谱条件进样分析，记录色谱图，计算出相似度在均在0.99以上，各主要色谱峰保留时间和峰面积的相对标准偏差均小于2.0%，表明重复性良好，符合指纹图谱要求。

3.4救必应UPLC指纹图谱的特征峰确定

取10批救必应提取物样品，按2.3.3方法制备供试液，按2.3.1色谱条件进样分析，记录色谱图。将10批救必应提取物样品指纹图谱的AIA数据文件导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A版)》软件进行分析，时间窗0.1，中位数法，以3号峰(紫丁香苷)和9号峰(长梗冬青苷)为参照峰经多点校正后自动匹配后生成救必应提取物的对照指纹图谱，并确定了11个共有峰，救必应提取物对照指纹图谱(共有模式)见图1。

图1 救必应提取物UPLC对照指纹图谱

3.5不同救必应药粉的指纹图谱相似度评价

将10批救必应提取物样品指纹图谱的AIA数据文件导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A版)》软件，计算各样品指纹图谱与生成的对照图谱R的相似度，各救必应提取物样品叠加指纹图谱见图2，相似度计算结果见表2。由表2可知，除第5、8、9批救必应提取物样品相似度较低外，其他批次样品与对照指纹图谱的相似度在0.947～0.978之间。

表2 与共有模式比较的各样品相似度评价

图2 救必应提取物UPLC指纹图谱

3.6不同批次救必应提取物牙膏抗菌性能评价

将10批救必应提取物分别加入到一个相同的基础牙膏配方体系中，然后对牙膏的抗菌性能(MIC值)进行考察。测试结果见表3。

表3 不同批次救必应提取物所做牙膏的MIC值(ppm)

从表3可以看出救必应提取物编号为IRC5、IRC8、IRC9所做的牙膏的最低抑菌浓度值较大，说明其抑菌效果较其他编号的牙膏差。编号为IRC1、IRC2、IRC3、IRC4、IRC6、IRC7、IRC10救必应提取物所做的牙膏其MIC值均较接近。由表2的相似度评价结果可知，IRC1、IRC2、IRC3、IRC4、IRC6、IRC7、IRC10救必应提取物相似度均较高，说明其成分组成较为相似，这与牙膏的抗菌性能测定结果是相一致的。

3.7不同批次救必应提取物牙膏的稳定性

将不同批次救必应提取物放入同一个牙膏配方中进行稳定性考察。表4的结果表明，除编号为IRC5、IRC8、IRC9救必应提取物所在牙膏外，其余各牙膏的稠度、pH值稳定，膏体没有出油、返粗、脱壳等现象，且香味、色泽、稳定性正常，各项质量指标全部符合国标GB8372-2008的要求。

3.8讨论

本研究以救必应提取物为例，在色谱测试条件上经过大量试验，建立了10批不同产地救必应提取物的UPLC指纹图谱。测试结果表明，9批救必应提取物的UPLC指纹图谱较为相似，说明各地救必应药材中化学成分种类较为一致。但是，不同样品之间同一色谱峰面积相差较大，说明各产地救必应药材之间化学成分含量比例差异较大。这可能是由于不同生长环境的影响而导致的。另一方面，将不同批次的救必应提取物应用于牙膏中，测定其抑菌性能及其牙膏的稳定性。结果表明，相似度高的救必应提取物所制作的牙膏的抗菌性能及稳定性同样趋于相似。

综上，中药色谱指纹图谱是一种综合的可量化的鉴别手段，符合中药整体性使用的特点。目前，其也是国际上认可的一种中药质量评价模式。因此，在中药提取物质量控制方面引入色谱指纹图谱作为评价手段，对提高产品的质量保证产品功效具有重要的作用。