濒危植物瑶山苣苔的大小孢子发生和雌雄配子体发育研究

施慧嫒 陈发菊 梁宏伟 王玉兵

（三峡区域植物遗传与种质创新重点实验室/三峡大学生物技术研究中心，宜昌 443002）

瑶山苣苔（Dayaoshania cotinifolia）为苦苣苔科（Gesneriaceae）瑶山苣苔属（Dayaoshania）多年生草本植物，仅分布于广西大瑶山局部地区［1］，因其仅有一个分布点，个体数量稀少，分布面积狭窄，且受人类活动的影响而处于濒危状态。在1999 年国务院颁布的《国家重点保护植物名录》（第一批）中被列为国家Ⅰ级保护植物；在2012 年原国家林业局颁布的《全国极小种群野生植物拯救保护实施方案（2010～2015）》中，瑶山苣苔被列为优先拯救保护的极小种群植物；在2013 年原环境保护部和中国科学院发布的《中国生物多样性红色名录——高等植物卷》中被评估为极危种（CR）（http：//www.mee.gov.cn/gkml/hbb/bgg/201309/t20130912_260061.htm）。目前，瑶山苣苔的生物学研究主要集中于开花生物学［2］、形态解剖学［3］、种群生态学［4～6］、组织培养［7～8］和保护遗传学［9］等方面，而与瑶山苣苔生殖生物学相关研究未见报导。本文利用常规石蜡切片法对瑶山苣苔的大小孢子和雌雄配子体发育进行研究，探讨其在该发育过程中是否存在致濒环节，其结果也可为瑶山苣苔及苦苣苔科植物的生殖生物学研究积累基础资料。

1 材料和方法

瑶山苣苔实验材料于2009 年5 月至2010 年7月采自广西壮族自治区金秀老山自然保护区。将不同发育时期的瑶山苣苔花芽和受精后的雌蕊材料于FAA 固定液（70%Ethyl alcohol 90ml：Acetic acid 5mL：Formalin 5mL）中固定24 h 后，带回实验室，分离出雌蕊和雄蕊并分别放入装有70%酒精溶液的小瓶中，置于4℃冰箱备用。采用常规石蜡切片法［10］，Laica RM切片机连续切片，切片厚度8 μm；采用番红—固绿（Safranin-Fast Green）对染法进行染色，脱水透明封片；用Nikon 80i显微镜观察与拍照。

2 结果与分析

2.1 花药壁的发育

瑶山苣苔一朵花中常具2枚雄蕊，雄蕊由花丝和花药组成，花药背着，每个花药具4个花粉囊（见图版Ⅰ：A）。早期花药为四棱形的花药原始体，花药原始体中部的细胞发育成药隔和维管束，随着花药原始体不断发育，其四个角隅处表皮下出现细胞核大、细胞质浓的孢原细胞。孢原细胞经过平周分裂，向外形成初生周缘细胞，向内产生初生造孢细胞。初生周缘细胞进行平周和垂周分裂形成4～5 层细胞的花药壁细胞；初生造孢细胞分裂形成次生造孢细胞，次生造孢细胞具有较大且明显的核，细胞质浓厚，染色较深，排列紧密整齐（见图版Ⅰ：B）。随着次生造孢细胞的进一步发育，花药壁细胞出现分化，当小孢子母细胞形成时，花药壁由外到内依次发育为表皮、药室内壁、中层和绒毡层（见图版Ⅰ：C）。在小孢子形成雄配子体的过程中，表皮下药室内壁细胞体积增大，径向延长，其细胞壁逐渐特化，发生带状纤维加厚，仅在相邻两个花粉囊连接处的细胞壁不加厚；在小孢子母细胞减数分裂时，中层细胞的储藏物逐渐减少，并在小孢子形成过程中逐渐解体被吸收，直至消失；花药壁最内层细胞体积明显增大，区别于其他花药壁层。绒毡层细胞初期为单核，细胞核大，呈多边形，细胞质浓厚，小孢子母细胞减数分裂之前，绒毡层细胞体积迅速扩大，并伴随液泡化。瑶山苣苔从5月份花芽分化开始细胞内容物迅速增加，此时绒毡层细胞发达，细胞质浓厚，排列整齐（见图版Ⅰ：D）；在小孢子进一步发育形成雄配子体的过程中，绒毡层不断解体，为小孢子的发育提供充足的营养（见图版Ⅰ：G），当花粉粒成熟时，绒毡层消失（见图版Ⅰ：H）。

2.2 小孢子发生及雄配子体形成

花发育到9月份，花药壁内的孢原细胞分化出初生造孢细胞，再经过数次有丝分裂，产生次生造孢细胞。次生造孢细胞继续发育，体积增大，细胞质浓厚；到9月初次生造孢细胞发育成多面形的小孢子母细胞（即花粉母细胞）（见图版Ⅰ：C）。随即小孢子母细胞进入减数分裂期，经第一次减数分裂形成两个子核，随即进入第二次减数分裂形成四个子核，此过程是连续型胞质分裂，而不伴随细胞板的形成；随后四分体小孢子逐渐形成自己的细胞壁，并包被在共同的胼胝质壁中，呈品字形（见图版Ⅰ：E）。刚释放出来的小孢子细胞形状不规则，伴随小孢子体积纵向扩展和细胞壁增厚，细胞质和细胞核在细胞的一侧，此时的小孢子细胞多呈肾形，长椭圆形，半球形（见图版Ⅰ：F）。随着小孢子体积的进一步增大，小孢子细胞质迅速液泡化形成大液泡，核大而胞质少，这时绒毡层细胞已经开始解体，把营养提供给小孢子以继续发育成熟，随着小孢子的发育，细胞质增多，小孢子细胞核移到细胞的一侧（见图版Ⅰ：G），形成单核靠边期小孢子。随后小孢子细胞中的液泡逐渐变小直至消失，核分裂形成一个大的生殖核和一个小的营养核，随后发生胞质分裂，生殖核游离在营养细胞的细胞质中，发育形成成熟花粉粒即雄配子体（见图版Ⅰ：H～I）。

雄配子体在同一花药室内发育时期基本同步，但同一花中不同花药的发育不同步。同时可以观察到瑶山苣苔花粉有极少部分败育现象，圆球形染色较深的为可育花粉；少量花粉皱缩，呈不规则的圆锥形或圆饼形，为败育花粉。

2.3 胚珠的发生与结构

瑶山苣苔的雌蕊由两个心皮组成，从子房横切面看，2 个心皮分别向近轴面（腹面）卷曲，与边缘的远轴面（背面）相连，并向子房室中部内伸，膨大分叉，内伸胎座膜上具有角质层，形成介于典型的侧膜胎座与典型的中央胎座之间的中间类型，子房1 室，多胚珠（见图版Ⅱ：A～B）。胚珠发生时在子房室特化的侧膜胎座处表皮下产生一团分生细胞即胚珠原基（见图版Ⅱ：D）；在大孢子时期，胚珠原基基部两侧表皮下的细胞分裂，向上生长，包住珠心，成为具2～3层细胞的单层珠被，其顶端留有珠孔，大孢子母细胞只被一层珠心组织所包围。珠被在发育过程中，围绕胚囊合点端至2/3胚囊处产生珠被绒毡层，胚囊成熟时，珠被及珠被绒毡层将胚囊包围。由于珠被和珠柄以及其他部分的不对称生长，使胚珠的珠孔一端逐渐向下方弯曲，成熟时胚珠为倒生型、单珠被、薄珠心（见图版Ⅱ：C）。

2.4 大孢子的发生发育及雌配子体的形成

胚珠发育初期，在靠近珠孔端表皮层下分化出细胞质浓厚、细胞核显著的大型细胞，即孢原细胞（见图版Ⅱ：D）。孢原细胞分裂形成周缘细胞和造孢细胞，周缘细胞进行平周和垂周分裂增加珠心组织，造孢细胞直接发育为大孢子母细胞，其细胞体积大，细胞质浓厚，具显著的细胞核，核仁明显，与周围珠心组织细胞有明显差异，包被在薄地珠心组织中（见图版Ⅱ：E）。随着胚珠的发育，珠被发育完全，胚珠倒生，大孢子母细胞进行减数分裂，合点端的1 个大孢子细胞明显增大，继续发育成为功能大孢子，位于珠孔端的其余3个大孢子不发育，很快退化（见图版Ⅱ：F）。功能大孢子沿珠孔—合点轴纵向伸长，体积增大并液泡化，形成单核胚囊（见图版Ⅱ：G）。经过1次有丝分裂，形成2个游离核，分别移到胚囊两极，形成2核胚囊（见图版Ⅱ：H），胚囊中出现多个液泡，2 核分别在珠孔端和合点端再分裂，形成4 核胚囊，随后再分裂一次，形成8 核胚囊（见图版Ⅱ：I～L）。8 个核位于共同的细胞质中，珠孔端和合点端各有4 个核，随后两端各有1个核向胚囊中央移动，融合形成二倍体的中央细胞，位于胚囊中央（见图版Ⅱ：J～K）。珠孔端的3个核分化形成1个卵细胞和2个助细胞的卵器，卵器包被浓厚的胚囊物质（见图版Ⅱ：J），合点端其余3个核分化出细胞壁，反足细胞成品字排列（见图版Ⅱ：L），形成成熟胚囊即雌配子体。

瑶山苣苔为胚珠倒生，单珠被，薄珠心，具有珠被绒毡层。雌配子体是由1 个功能大孢子发育而来，形成7 孢8 核胚囊，这种胚囊发育方式被称为单孢子—蓼型胚囊，这一发育特点属于原始发育类型。

2.5 胚和胚乳的发育

瑶山苣苔成熟胚囊发生双受精以后，受精极核（见图Ⅲ：A）的分裂早于合子，随着初生胚乳核的分裂，将胚囊分割成大小不等的2 个腔，大的靠近珠孔端，小的靠近合点端，并分别由此发育出珠孔吸器和合点吸器（见图Ⅲ：B）。合点吸器在胚乳发育早期将位于珠被最外层和珠被绒毡层之间的珠被细胞逐渐吸收解体，形成较大的空腔；而此时的珠孔吸器内的核未分裂，细胞质浓厚，染色较深。当受精卵发育成4细胞原胚时，吸器内的细胞高度液泡化，向外伸展，形成外珠孔，并逐步将包围在珠孔端的珠被细胞吸收解体，珠孔吸器在随后胚的发育过程中残存较长时间。

位于珠孔吸器与合点吸器间的胚乳核经两次横分裂形成直线排列的4 核胚乳（见图Ⅲ：B），随即形成细胞壁，胚乳细胞在随后的分裂过程中均伴随细胞壁的分化，瑶山苣苔的胚乳发育为细胞型（见图Ⅲ：C），在胚的发育过程中，胚乳被胚吸收耗尽（见图Ⅲ：F）。

瑶山苣苔的卵细胞受精以后，经过短暂休眠从珠孔伸入早期胚乳核游离的腔中（见图Ⅲ：D）。随着胚乳的发育，休眠合子经1 次横向分裂，形成一个顶细胞和一个基细胞。顶细胞再进行2 次纵向分裂形成4 细胞原胚，随后经1 次横分裂形成8细胞原胚（见图Ⅲ：E），再经几次分裂形成多细胞球胚，至此不再分裂直到果实成熟；基细胞经几次横分裂形成胚柄，瑶山苣苔的胚柄在胚的发育过程中并不解体。随着胚和胚乳的发育，珠被外表皮呈瓦片状增厚，发育成为外种皮，珠被绒毡层细胞壁增厚发育为内种皮。

3 讨论

植物生殖生物学的性状因受外部环境因素的影响较少而具有相对的遗传稳定性，是系统学及分类学研究的重要内容，特别在进行属以上的系统发育研究时具有重要的意义［11］。瑶山苣苔胚珠倒生、单珠被、薄珠心，具有珠被绒毡层，胚囊为单孢子发生类型，属典型的蓼型胚囊发育方式，这些发育特征与苦苣苔科其他植物胚胎的发育方式基本相似［12～18］，表明瑶山苣苔与其他苦苣苔科各属种之间系统发育上具有一致性，这一研究结果也为苦苣苔科植物的胚囊发育的类型确定提供了新的佐证资料。

本研究表明，瑶山苣苔即具有一些较为原始的胚胎学特征，如倒生胚珠、二核花粉粒、单孢子胚囊的蓼形胚囊等［16，19］；同时，瑶山苣苔也具有较为进化的胚胎学特征，如绒毡层为较进化的腺质绒毡层和单珠被，表明瑶山苣苔的胚胎学特征具有过渡特征。王文采认为瑶山苣苔的雄蕊着生于花冠近基部处，花药二室平行，不开叉，是苦苣苔科较为原始的属种［1］。由于苦苣苔科植物的胚胎学信息较少，本研究虽不能确定瑶山苣苔的系统位置，但可以推测瑶山苣苔是苦苣苔科系统进化中是由原始向进化的一种过渡植物类群。

植物的有性生殖成功与否对物种的延续和种群的拓展起决定性作用，而与植物有性生殖相关的过程包括花器官的分化、雌雄配子的形成、传粉受精、胚胎发育以及种子的形成等，这些生殖过程中的任何一个环节出现异常现象，都将不同程度地导致生殖失败，进而可能引起植物濒危［20］。瑶山苣苔在雌雄配子体发育及胚胎发育过程的细胞学观察，发现有少量花粉败育现象，但其花粉量大，绝大部分均为发育成熟，少量的花粉败育对其生殖成功影响不大；雌配子体形成过程中也未见异常的现象，表明雌配子体形成在瑶山苣苔的胚胎发育过程中可以正常发育，不是导致其濒危的原因。

瑶山苣苔在果实发育成熟时，胚仅发育至球形胚时期，需要经过一定时间的休眠才能完成形态后熟；而瑶山苣苔果实成熟已是深秋，自然条件下，要经过一个相对干旱寒冷的冬季，可能影响种子胚的形态后熟，从而导致种子萌发率降低。在野外调查中发现，在瑶山苣苔群落较大的种群附近，很少见到瑶山苣苔的幼苗，这很可能是造成瑶山苣苔濒危的主要内在原因。