宿主细胞残留D N A 片段大小分布检测方法的建立及验证

闫璐瑶，张家友，张青梅，张哲罡，夏志武，邱冉，刘京，杨晓明

1.武汉生物制品研究所病毒性疫苗研究二室，湖北武汉430207；2.国家联合疫苗工程技术研究中心，湖北 武汉430207；3.中国生物技术股份有限公司，北京100029

宿主细胞残留DNA 是指可能出现于生物制品中的来自宿主组织细胞的DNA 片段或更长的分子，其可能存在于最终的产品中［1］。目前，许多生物制品以细胞为生产基质，宿主细胞残留DNA 给病毒疫苗等连续细胞系衍生的生物制品造成了潜在的安全风险。相关的风险主要为感染性和致癌性，如存在逆转录病毒前病毒，其基因整合入受试者基因组则可能导致感染；病毒或传代细胞基质的致癌基因则有可能具有引发肿瘤的潜在风险［2-4］。

国内外各类监管机构出台了生物制品中可接受的宿主细胞残留DNA 水平的指导方针，世界卫生组织（World Health Organization，WHO）要求生物制品终产品中宿主细胞DNA 残留量不得超过10 ng ／ 剂量［5］，美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）规定宿主细胞残留DNA 不高于100 pg ／ 剂量、长度不大于300 bp［6］，《中国药典》三部（2020 版）中规定宿主细胞残留DNA 不高于50 pg ／ 剂量［7］。考虑到细胞基质的特性和生物制品的用途等因素，DNA 残留量应控制在更低水平，除了残留DNA 的数量外，大小分布也是确定其相关危险因素的重要指标。

各国药典陆续提供了数种关于宿主细胞残留DNA 定量检测的经典方法，包括阈值法、杂交法、荧光染色法及实时荧光定量PCR 法，但均未对残留DNA 片段大小的检测方法给出明确指导。一般认为，DNA 片段在300 bp 以上可整合至受试者基因组，编码有功能的蛋白，增加了残留DNA 的风险［8］。因此，为优化疫苗质量控制，本研究基于高灵敏的微型化芯片电泳法，建立了一种操作简便、结果直观、检测灵敏、具有良好精密度的宿主细胞DNA 残留片段大小分布的检测方法，并对MDCK（Madin-Darby canine kidney）细胞基质流感疫苗生产过程中间品进行检测，有望用于连续细胞系衍生生物制品的原液检定和质量控制。

1 材料与方法

1.1 供试品 MDCK 细胞基质四价流感疫苗生产中间品：H1N1 型流感病毒收获液、病毒微滤液、核酸酶处理收获液、浓缩病毒液、层析病毒液，批号：202006Z002H1，由武汉生物制品研究所病毒性疫苗研究二室提供。

1.2 细胞 MDCK 细胞购自ATCC（美国标准菌种保藏中心），编号CCL-34，由武汉生物制品研究所病毒性疫苗研究二室保存。

1.3 主要试剂及仪器 磁珠法动物基因组DNA 提取试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司；样品残留DNA 提取试剂盒购自湖州申科生物技术有限公司；Agilent 2100 生物分析系统及高灵敏度DNA 试剂盒购自美国Agilent 科技有限公司；Microdrop 紫外可见分光光度计购自上海宝予德科学仪器有限公司。

1.4 M D C K 细胞基因组提取 采用磁珠法动物基因组DNA 提取试剂盒，具体操作按试剂盒说明书进行。取10 mL 贴壁细胞消化液于15 mL 离心管中，离心弃上清，加入抽提缓冲液和Proteinase K，65 ℃水浴30 min；15 294 ×g离心10 min，取上清至新的1.5 mL 离心管中，加入20 μL RNase A（10 mg／mL），加入结合液和磁珠，分离磁珠；弃上清，加入700 μL 70%乙醇，分离磁珠；弃上清，洗涤1 次，将离心管开盖干燥20 min，去残留乙醇；加入100 μL TE Buffer，65 ℃水浴10 min；分离磁珠，上清即为细胞基因组。抽提样品经1%琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计鉴定浓度和纯度。

1.5 样品残留D N A 提取 采用样品残留DNA 提取试剂盒，具体操作按试剂盒说明书进行。取100 μL供试品，加入蛋白酶K 溶液，混匀后55 ℃水浴1 h，使膜蛋白降解、与DNA 结合的蛋白质降解、DNA 充分游离；加入200 μL 异丙醇和10 μL 磁珠，使游离DNA 与磁珠充分结合，分离磁珠；加入各700 μL 洗涤液A 和B，使磁珠和洗涤液混匀，完成2 次磁珠洗涤；将离心管开盖干燥10 min，除去残留乙醇；加入100 μL 预热洗脱液，混匀后70 ℃水浴10 min，分离磁珠；上清即为DNA 纯化液，经紫外可见分光光度计测定浓度和纯度。

1.6 方法的建立 准备底盘在C 位置，调整注射器卡夹在最低位置。准备凝胶染料混合物：将DNA 染料（蓝色）和凝胶（红色）室温平衡30 min；将15 μL DNA 染料加入凝胶中，充分混匀并离心，转移至离心过滤管，2 240 ×g离心15 min；混合物需在6 周内使用完毕。凝胶注入：将一张新的芯片放在芯片槽内，在第1 孔注入9 μL 凝胶染料混合物，确保注射器推杆在1 mL 位置，盖上注胶平台盖子，匀速按压注射器推杆直至固定架卡扣卡住，等待60 s 松开卡扣，等待5 s 注射器推杆稳定后，将其缓慢拉回至1 mL 刻度，分别在2、3、4 孔加入9 μL 凝胶染料混合物，5 ～ 16 孔分别加入5 μL marker（绿色）；在第5 孔加入1 μL 高灵敏度DNA ladder（黄色），第6 ～ 16 孔加入1 μL 准备好的样品；将芯片放入水平适配振荡器中，612 ×g振荡1 min；将芯片放入仪器开始运行。

1.7 方法的验证

1.7.1 检测范围 使用高灵敏度DNA 试剂盒中包含35 和10 380 bp 的2 个marker 和包含50、100、150、200、300、400、500、600、700、1 000、2 000、3 000和7 000 bp 的13 个等质量DNA 片段的ladder，检测系统的性能，并确定各峰迁移时间。

1.7.2 精密度 取H1N1 型流感病毒浓缩液样品，按1.5 项方法抽提样品宿主细胞残留DNA，平行设3 份样品，同一样品由3 名实验员按1.6 项方法分析残留DNA 的片段大小分布，且同一名实验员对同一样品连续检测3 次，计算300 bp 以下片段占总外源DNA 的比例，并计算CV。

1.8 方法的初步应用 取H1N1 型流感病毒收获液、病毒微滤液、核酸酶处理收获液、浓缩病毒液、层析病毒液样品，按照1.5 项方法提取宿主细胞残留DNA，按照1.6 项方法分析残留DNA 的片段大小分布。

2 结 果

2.1 M D C K 细胞基因组的鉴定 抽提的细胞基因组DNA 浓度为933.06 ng ／ μL，A260／280值为2.079，浓度和纯度均较高。1%琼脂糖凝胶电泳DNA 显示有1 条清晰条带，大量弥散条带，符合全基因组DNA 电泳特征，可作为阳性对照，见图1；芯片电泳显示有连续分布的核酸片段，琼脂糖凝胶电泳模拟图与实验室电泳图显示结果一致，均有大量弥散条带，见图2。

2.2 方法的验证

2.2.1 检测范围 高灵敏度DNA ladder 可检测35～10 380 bp 的条带；35 bp DNA 含量为125 pg ／ μL，10 380 bp DNA 含量为75 pg ／ μL，其余ladder 条带DNA 含量均为150 pg ／ μL。见图3。

图1 MDCK 细胞基因组琼脂糖凝胶电泳图Fig.1 Agarose gel chromatographic profile of genome of MDCK cells

图2 芯片电泳图及模拟琼脂糖凝胶电泳图Fig.2 Chip and mimic agarose gel chromatographic profiles

图3 DNA ladder 芯片电泳图Fig.3 Electrophoretic profile of DNA ladder

2.2.2 精密度 3 名实验员对相应样品重复检测3次，300 bp 以下片段所占百分比检测结果的CV分别为1.46%、3.35%和4.00%，不同实验员间检测结果的CV分别为2.91%、1.94%和4.33%，见表1，表明该方法具有良好的精密度。

表1 精密度验证结果（%）Tab.1 Verification for precision（%）

2.3 方法的应用 病毒收获液及病毒微滤液外源DNA片段较大，经核酸酶处理后，大部分残留DNA小于300 bp，所有残留DNA 平均大小约100 bp，且层析病毒液300 bp 以下片段占总外源DNA 的84%，见图4 和表2。

表2 残留DNA 片段大小分布比例（%）Tab.2 Size distribution proportions of residual DNA fragments（%）

图4 H1N1 病毒收获液（A）、病毒微滤液（B）、核酸酶处理收获液（C）、浓缩病毒液（D）、层析病毒液（E）样品芯片电泳图及模拟琼脂糖凝胶电泳图Fig.4 Chip electrophoretic profile and mimic agarose gel electrophoretic profile of harvest of influenza H1N1 virus（A），microfiltration fluid of virus（B），virus digested with nuclease（C），concentrated virus（D）and the virus purified by chromatography（E）

3 讨 论

目前市场上各种细胞系衍生生物制品越来越多，细胞系的种类、代次、生长特性等直接影响产品的质量和产量，尤其是产品的安全性［9］。其中，宿主细胞残留DNA 被国内外监管机构关注，在病毒性疫苗中，外源DNA 尽管有着相同的双螺旋结构，但其片段长度不同，以不同的物理形式存在，可能将激活的癌基因或具有传染性的病毒基因组传递给疫苗接种者［10-11］。因此，为监测疫苗生产过程中宿主细胞残留DNA 的量和片段大小分布，需要建立一个准确、灵敏的方法。

毛细管电泳是粒子在高压电场驱动下，在毛细管中按其滴度或分配系数，进行高效、快速分离的一种电泳技术。当配置有激光诱导荧光模块时，可灵敏分析低浓度和小体积的核酸。本研究根据高灵敏度的芯片法毛细管电泳技术，建立了宿主细胞残留DNA 片段分布检测的方法，并对该方法的检测范围、精密度进行了验证。结果表明，该方法可明确分析35 ～ 10 380 bp 之内的片段分布，对于区间外的片段，也可给出一个片段大小预测供参考；精密度验证各次检测CV均小于10%，表明该方法具有良好的精密度。同时，该方法可根据已知的DNA ladder给出片段的相对含量，并计算各片段分布的占比，直观地反映了样品中残留DNA 的情况，为监测疫苗生产流程提供了依据。

与传统的鸡胚基质流感疫苗相比，细胞基质流感疫苗具有更标准化和成熟的制备技术，更容易大规模生产，并且在细胞中复制的病毒可能更适应人体［12］。也有数据证实，细胞基质流感疫苗安全性和免疫原性更好［13］。新的细胞基质存在新的挑战及风险，MDCK 细胞是一种犬肾细胞，具有无限传代的能力，因此其致瘤性和成瘤性问题备受关注。MDCK细胞基质流感疫苗生产工艺（包括超滤、核酸酶处理、层析、β-丙内酯灭活等）过程中，大量宿主细胞残留DNA 已被去除，且大多已断裂成300 bp 以下的DNA 片段［14］。本研究应用该方法对H1N1 型流感疫苗生产中间品进行宿主细胞残留DNA 片段大小分布检测，结果表明，病毒收获液及病毒微滤液外源DNA 片段较大，经核酸酶处理可将大片段的残留DNA 酶解为小于300 bp 的片段，且层析病毒液中300 bp 以下的片段占总外源DNA 的84%，后续纯化步骤也可进一步去除外源DNA。

综上所述，本实验建立的芯片法毛细管电泳精密度良好，通过分析外源DNA 片段大小分布情况，可监控细胞基质流感疫苗生产过程，为生产工艺优化提供依据，为质量控制提供支持，同时也可能为其他细胞系衍生疫苗的生产工艺提供依据。