ZEB2 在鼻腔鼻窦内翻性乳头状瘤中的表达及意义*

石书婧 侯君 梁华 王学霞 苏兰 耿红亚 张晓岚 田永涛 王建国

鼻腔鼻窦内翻性乳头状瘤 (sinonasal inverted papilloma,SNIP)是一种良性肿瘤，起源于鼻侧壁或鼻窦的呼吸型(呼吸器型)上皮[1-3]。10%～25%的SNIP 患者具有局部复发或转化为鼻窦鳞状细胞癌的可能[1，4，5]。目前发病机制仍不明确。上皮间质转化（Epithelial mesenchymal transition, EMT）是生物体发生发展及上皮性肿瘤癌变的一个关键过程[6，7]。研究表明，转录因子ZEB2 与EMT 相关，是促进肿瘤发生发展的关键因素。本文应用免疫组织化学SP法检测ZEB2 蛋白在SNIP 及增生鼻甲组织中的表达差异，并探讨其表达水平与SNIP 发生、发展及恶变的关系。

资料与方法

1 材料

1.1标本

收集2016～2018年在我院经病理证实的新鲜标本共71 例，其中SNIP 51 例、增生鼻甲组织（鼻中隔矫正术中切取的增生鼻甲组织）20 例。SNIP 组，男 31 例，女 20 例，年龄 22～74 岁，中位年龄 52.5岁；对照组（增生鼻甲组织），男11 例，女9 例，年龄20～59 岁，中位年龄48 岁，两组间性别、年龄差异无统计学意义。所有病例入院前未进行过放疗及化疗等治疗措施，见表1。

1.2试剂

ZEB2 兔源多克隆抗体（Bioworld）、通用 SP 试剂盒（小鼠/兔链霉卵白素-生物素法检测系统）和DAB（中杉金桥）。

2 方法

2.1实验分组

首先分为对照组和SNIP 组。SNIP 组根据复发与否、Krouse（2000年）SNIP 临床分期标准及病理分型分别分为初发组和复发组；Ⅰ期、Ⅱ期组和Ⅲ期、Ⅳ期组；无不典型增生组、伴不典型增生组和恶变组[8]。

2.2采用免疫组织化学SP 法检测石蜡切片中ZEB2蛋白的表达。按照试剂盒说明进行染色。常规烤片、脱蜡及水化，将切片放入沸腾的柠檬酸盐缓冲液中进行高压抗原修复5min，蒸馏水冲洗，室温冷却后PBS 液漂洗，3%过氧化氢甲醇避光处理10min 以阻断内源性过氧化物酶活性，PBS 漂洗后使用10%山羊血清封闭非特异性抗原，弃血清加一抗（ZEB2 兔源多克隆抗体），PBS 缓冲液代替一抗为阴性对照，4℃冰箱过夜，滴加生物素标记山羊抗小鼠/兔IgG聚合物，室温孵育15min 后进行漂洗，滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，室温孵育15min，再次漂洗后滴加DAB 显色剂显色，苏木精复染、1%盐酸乙醇分化、蒸馏水返蓝、脱水、透明、封片。

2.3结果判定

结果由两名对患者信息不知情的病理科医生进行判定。每张切片高倍镜下（×400）随机选择5 个视野进行观察，每个视野计数细胞数不少于100个。以细胞膜、细胞质或细胞核出现棕黄色颗粒为阳性。以阳性细胞所占百分比及染色强度进行分级。阳性细胞比例：≦10%为1 分，＞10%且＜50%为2分，＞50%为3 分；染色强度：无着色为0 分，淡黄色为1 分，棕黄色为2 分，棕褐色为3 分。染色强度和阳性细胞比例乘积得分为0～4 分者为阴性，6、9 分为阳性。

3 统计学方法

应用SPSS 16.0 统计软件。计数资料以率（%）表示，采用 χ2检验或 Fishier 确切概率法，P＜0.05 为差异具有统计学意义。

结果

1 ZEB2 蛋白在对照组及SNIP 组中的表达差异

ZEB2 阳性表达主要定位于细胞质和细胞核，在SNIP 组中表现为细胞质或细胞核呈棕褐色颗粒，阳性表达率为45.1%，而在对照组中表达明显减弱甚至出现表达缺失，阳性表达率为15%，两者比较差异具有统计学意义（P＜0.05），见表1、图1。

表1 ZEB2 蛋白表达与临床病理参数的关系

表2 ZEB2 蛋白在不同病理分型SNIP 与对照组的比较

图1 ZEB2 蛋白在对照组及不同病理分型的SNIP 组织中的表达

2 ZEB2 与SNIP 组临床病理参数之间的关系

结果显示：ZEB2 蛋白表达水平与SNIP 患者性别、年龄、临床分期和有无复发无明显相关（P＞0.05），而与病理分化程度有关（P＜0.05），见表 1，随病理分化程度降低ZEB2 表达量增加（见图1）。

3 ZEB2 蛋白在不同病理分化程度SNIP 与对照组的比较

结果显示：ZEB2 蛋白在对照组、SNIP 无不典型增生组、伴不典型增生组、伴恶变组中的阳性表达率逐渐升高分别为15%、31%、56.2%、83.3%，其中伴不典型增生组、伴恶变组与对照组相比差异具有统计学意义（P＜0.05），而无不典型增生组与对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

讨论

鼻乳头状瘤或鼻窦乳头状瘤是一种良性上皮性肿瘤，由鼻腔和鼻窦周围的施耐德氏膜形成，组织形态学上可分为外生性、内翻性和癌细胞型三种类型，其中内翻性约占所有鼻乳头状瘤的47%[9]。SNIP 可发生于任何年龄段，但更常见于五六十岁的男性，此肿瘤与其他鼻腔肿瘤相比有以下三个特点：较强的局部破坏潜力、较高的复发率和癌变的风险。迄今为止，SNIP 的确切病因尚不明确，研究表明其发病原因可能与病毒感染、炎症刺激及上皮化生等相关[10]。

EMT 使上皮细胞获得间质特性，显著增加肿瘤细胞的迁移和侵袭性[11]，通常认为EMT 与肿瘤的发生、恶性进展、细胞迁移及肿瘤转移等相关。EMT 常被定义为上皮标志物（如E-cadherin）表达下调，间质标志物（如N-cadherin、Vimentin）表达增加。此外，EMT 相关转录因子（TFs），如 SNAI（SNAI1/Snail 和SNAI2/Slug）、ZEB（ZEB1 和 ZEB2）、TWIST（TWIST1和TWIST2）等核蛋白可以通过不同的信号通路[12]来抑制E-cadherin 的表达，从而调控EMT 过程。E 盒结合锌指蛋白2（zinc finger E－box binding homeobox 2, ZEB2）是E 盒结合锌指蛋白家族成员之一，属于锌指结构转录因子，在胚胎发育和肿瘤进展过程中起着关键作用。ZEB2 被广泛认为是EMT 的诱导剂，易翔等[13]研究表明ZEB2 在鼻咽癌组织中表达明显升高，其高表达可能促进EMT 发生，进而增加鼻咽癌的侵袭转移几率。Chen 等[14]研究发现ZEB2 在鼻咽癌组织及细胞系中高表达，miRNA-30a 在鼻咽癌组织及细胞系中表达降低，ZEB2 是miRNA-30a 在人鼻咽癌中的靶点，miRNA-30a 通过直接与ZEB2的3-UTR 结合而负调控其表达水平，miR-30a 过表达通过抑制ZEB2 的表达，增加人鼻咽癌细胞的凋亡水平，抑制鼻咽癌细胞的增殖、迁移和侵袭。Pan等[15]研究发现MTBP 可能通过上调ZEB2 表达诱导EMT 过程，促进非小细胞肺癌的侵袭性。Suzuki 等[16]进行体内外实验后发现，ZEB2 在胶质瘤细胞中存在高表达，下调ZEB2 的表达可抑制肿瘤侵袭性。Gao 等[17]研究表明miRNA-1179 在肝癌组织和细胞系中表达下调，miRNA-1179 低表达的肝癌患者有着更高的转移率(淋巴转移和远处转移)，预后更差，miRNA-1179 的过表达减弱了肝癌细胞的增殖和迁移能力，ZEB2 被证实是miRNA-1179 的直接靶点，其水平被miRNA-1179 负调控。ZEB2 在肝癌组织和细胞系中上调，ZEB2 的高表达预示肝癌患者的预后较差。ZEB2 的过表达逆转了miRNA-1179 对HCC 细胞增殖和迁移能力的抑制作用。以上研究表明：ZEB2 在鼻咽癌、非小细胞肺癌、肝癌及胶质瘤中高表达并且与肿瘤侵袭性有关。

本研究应用免疫组织化学方法测定ZEB2 蛋白在SNIP 组及对照组中的表达情况并行相关分析，结果表明：ZEB2 蛋白表达水平在SNIP 组中明显升高，与对照组相比差异具有统计学意义（P＜0.05），其表达水平与性别、年龄等因素无明显相关，与病理分型有关（P＜0.05），其表达量随SNIP 病理分化程度降低而增加，这与上述研究报道的结果相符，其中伴不典型增生组、伴恶变组与对照组相比差异具有统计学意义（P＜0.05），而无不典型增生组与对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。该结果提示：ZEB2 的高表达与SNIP 的发生、发展及恶变有关，检测ZEB2 的表达在预测SNIP 恶变、评估预后及指导临床治疗等方面可能具有重要意义。此外，在该研究中，我们还进行了E-cadherin 表达的测定，结果显示：E-cadherin 在SNIP 中的表达量低于对照组，且随SNIP 病理分化程度的降低表达量逐渐下降，ZEB2 与E-cadherin 相关性分析显示两者之间存在负相关，该结果亦提示ZEB2 可能通过影响EMT 进程进而影响肿瘤的发生、发展及恶变，这方面的内容将在后续的文章中进行叙述。