癌组织lncRNA H19和血清前列腺特异抗原水平与前列腺癌病理特征及预后的相关性

徐 峰，杨 勇，刘忠平

(1.航天中心医院泌尿外科，北京 100049；2.解放军总医院第四医学中心泌尿外科，北京 100037)

目前，针对前列腺癌(PCa)的术前诊断和预后判断方法均存在着的一定不足[1]，前列腺特异抗原(PSA)等标志物虽然敏感度较高，但受到多种混杂因素影响，有研究[2]证实了长链非编码RNA(lncRNA)的表达异常与泌尿系统恶性肿瘤的发生和发展密切相关，lncRNA H19已被证实在多种恶性肿瘤病程中具有重要作用，但其能否用于提示PCa病理特征并预测患者预后仍存在争议。本研究针对癌组织lncRNA H19和血清PSA水平与PCa病理特征及预后的相关性进行了分析，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2015年3月至2017年3月由航天中心医院收治的89例PCa患者作为病例组，纳入标准：①符合2016年发布的《前列腺癌指南》中的PCa诊断标准[3]；②患者均为局限PCa，临床分期为Ⅰ～Ⅲ期；③预期寿命≥10年；④具有行根治手术指证，均择期开放式耻骨后PCa根治术和腹腔镜PCa根治术。选取同期100例良性前列腺增生(BPH)患者作为对照组，纳入标准：①符合中华医学会泌尿外科分会于2006年制订的《良性前列腺增生临床诊治指南》中的BPH诊断标准[4]；②具有手术指证，均为择期行经尿道前列腺电切术、经尿道前列腺切开术或开放前列腺摘除术。排除标准：①合并心血管疾病、肺功能不良、肝肾功能衰竭、严重出血倾向或凝血功能障碍者；②复发性PCa患者；③术前明确确诊肿瘤骨转移者；④合并其它部位恶性肿瘤者；⑤术前已接受抗肿瘤治疗者。所有患者均签署知情同意书自愿参，本研究经医院医学伦理委员会通过。

1.2 方法

1.2.1前列腺组织lncRNA H19相对表达量检测 取两组患者术中切除前列腺病灶组织切片，经脱蜡等处理后采用Trizol reagent RNA提取试剂盒(美国Invitrogen公司)提取总RNA，采用实时聚合酶链式反应(RT-PCR)法检测病灶组织中的lnRNA H19相对表达量，检测仪器为ABI 7500型荧光定量PCR仪(美国ABI公司)，采用cDNA：PrimerScriptTMRT试剂盒将2 μg RNA提取物反转录为cDNA，采用SYBR Premix Ex TaqTMqRT-PCR试剂盒进行PCR扩增，以U6为内参，目标RNA的PCR扩增引物序列见表1，采用20 μl反应体系，反应条件为：95 ℃变性5 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，共反应40个循环，72 ℃ 20 s，78 ℃ 20 s采集荧光，采用熔解曲线及琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行分析，根据PCR反应结果计算循环阈值(Ct)，采用2-△△Ct法计算目标RNA的相对表达量。

表1 目标RNA的PCR扩增引物序列

1.2.2血清PSA水平检测 于入院次日常规采集两组患者的空腹外周静脉血样本，采用免疫层析法检测血清PSA水平进行检测，以≤5.0 ng/ml为血清PSA水平正常生理范围，将血清PSA水平≥20 ng/ml判定为高血清PSA水平。

1.2.3基线资料及病理特征收集 通过查阅病历针对两组患者的年龄、合并基础疾病及前列腺体积等基线资料进行对比，同时对病例组患者的肿瘤直径、临床分期、Gleason病理分级评分、分化程度、淋巴结转移等病理特征进行统计和调查。

1.2.4预后情况调查 所有患者均于术后给予最长36个月的随访，随访方式以电话微信随访为主，每周至少随访一次，每三个月至少进行一次门诊随访，如患者不能按期接受随访，则进行登门随访，对患者的总生存期(OS)和无进展生存期(PFS)进行随访，其中，OS的终点事件为患者全因死亡，PFS的终点事件为肿瘤进展或复发，如患者者生存期长于末次随访，其生存数据记为删失数据。

1.3 观察指标①观察患者术中切除前列腺病灶组织lncRNA H19相对表达量、入院时血清PSA水平。②病例组患者基线资料及病理特征，术后患者总生OS和PFS。

1.4 统计学方法采用SPSS 23.0 软件分析数据。计量资料比较采用t检验；偏态资料比较采用秩和检验；计数资料比较采用χ2检验或Fisher确切概率法；OS、PFS的比较采用Kaplan-Meier生存分析法；采用Cox风险回归模型对患者OS和PFS相关因素进行多因素分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组基线资料、病灶组织lncRNA H19相对表达量和血清PSA水平比较两组基线资料比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，病例组病灶组织中lncRNA H19相对表达量和血清PSA水平均高于对照组(P<0.05)。见表2。

表2 两组基线资料、病灶组织lncRNA H19相对表达量和血清PSA水平比较

2.2 不同病理特征PC患者病灶组织lncRNA H19相对表达量和血清PSA水平的比较不同年龄、合并糖尿病情况、前列腺体积、临床分期、Gleason评分、肿瘤分化程度患者血清PSA水平差异有统计学意义(P<0.05)，不同临床分期、Gleason评分、肿瘤分化程度、淋巴结转移情况的病灶组织中lncRNA H19相对表达量差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 不同病理特征PC患者病灶组织lncRNA H19相对表达量和血清PSA水平的比较

2.3 病灶组织lncRNA H19相对表达量和血清PSA水平与PCa患者预后的相关性随访期截至2020年3月，本组患者的总体OS和PFS估计值为25.181个月和23.158个月，以患者术中切除肿瘤病灶lncRNA H19相对表达量平均值为界值将患者分为高lncRNA H19表达组(病灶lncRNA H19相对表达量≥1.45，45例)和低lncRNA H19表达组(病灶lncRNA H19相对表达量<1.45，44例)，根据血清PSA水平将患者分为高血清PSA水平组(48例)和低血清PSA水平组(41例)。Kaplan-Meier生存分析结果显示，高lncRNA H19表达组OS和PFS均低于低lncRNA H19表达组(P<0.05)，而高血清PSA水平组和低血清PSA水平组OS和PFS比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表4、图1。Cox风险回归模型分析结果显示，前列腺患者术后OS与病灶组织lncRNA H19相对表达量、临床分期、淋巴结转移情况、Gleason评分、分化程度相关(P<0.05)，术后PFS与病灶组织lncRNA H19相对表达量、淋巴结转移情况、Gleason评分相关(P<0.05)，其中，较高的病灶组织lncRNA H19相对表达量是患者不良预后风险的因素。见表5、表6。

表4 不同病灶组织lncRNA H19相对表达量和血清PSA水平患者术后OS和PFS比较

图1 不同病灶组织lncRNA H19相对表达量和血清PSA水平患者术后OS和PFS的Kaplan-Meier生存分析曲线 a：lncRNA H19；b：PSA

表5 前列腺患者术后OS相关因素的Cox风险回归模型分析

表6 前列腺患者术后PFS相关因素的Cox风险回归模型分析

3 讨论

Gleason评分用于辅助预测术后局部复发及淋巴结或远处转移的风险，而有无阳性淋巴结转移或远处转移是决定PCa预后的关键因素[5]。随着研究的深入，学者们发现病理学分级及临床分期对PCa的预后评价存在一定的局限性，肿瘤相关基因在PCa发生发展中的作用及其预后预测价值越来越受到关注，lncRNA、微小RNA(miRNA)、环状RNA(circRNA)等ncRNA携带着肿瘤遗传信息、能够对下游靶基因和肿瘤微环境发挥重要的调节作用，在PCa诊疗方面得到了广泛的应用，研究[6]已证实了PCa组织中的多种miRNA表达异常与患者预后有关，作为miRNA的上游调控基因，lncRNA能够通过发挥类似癌基因或抑癌基因的作用参与PCa细胞的增殖、侵袭、转移等的调控，在PCa的诊断、治疗及预后方面应用潜力巨大，有望作为用于PCa的早期诊断、靶向治疗等方面。lncRNA的异常表达可作用于表观遗传、转录及转录后等多个基因调控水平，导致PCa细胞生物学行为改变，一些lncRNA被证实与PCa的去势抵抗性密切相关，有多种从PCa癌组织、前列腺液、血清、尿液等标本中检出的异常表达lncRNA可影响肿瘤对于放疗和化疗的反应性，还有一些lncRNA的异常表达与患者的预后有关[7]，这也成为了PCa研究领域的热点。

通过本研究可见，PCa癌组织中lncRNA H19相对表达量出现了上调，且与肿瘤的病理特征和患者的预后相关。lncRNA H19是最早发现的lncRNA之一，位于人类染色体11p15.5上，可与胰岛素样生长因子2(IGF-2)产生相互作用，是一种表现出父系印记的lncRNA分子。lncRNA H19在多种肿瘤组织中存在表达异常并与不良预后具有相关性，能够与多种癌基因、抑癌基因、miRNA发生相互作用，从而调控肿瘤的生长、增殖、分化凋亡及侵袭转移等生物学行为。lncRNA H19在PCa组织中呈现高表达，通过抑制其表达可降低肿瘤细胞的生长能力、葡萄糖消耗量和乳酸生成量，达到抑癌作用；lncRNA H19 rs2839698、rs2735971基因单核苷酸多态性与PCa易感性有关，携带突变等位基因的人群的PCa发生风险较高。然而，肿瘤组织中的lncRNA H19过表达与PCa预后的相关性仍不明确，而本研究结果支持了癌组织lncRNA H19高表达与PCa患者不良预后有关的结论，这提示了lncRNA H19也可作为PCa的预后评价指标及治疗靶点。事实上，lncRNA H19在促进恶性肿瘤进展中的机制十分复杂，除了上述提到了与肿瘤细胞能量代谢的相关性之外，主要还包括以下几个方面的机制：①lncRNA H19可对miRNA-675、miRNA-107、miRNA-141等下游靶基因进行调控，从而提升癌细胞在机体内增殖与侵袭能力[8，9]；②高表达的lncRNA H19可对E-cadherin、Bcl2、CPT1C、Atg7等相关蛋白信号通路发挥调控作用，从而促进肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移[10～12]；③肿瘤细胞以lncRNA H19高表达外泌体方式通过激活PI3K/AKT/mTOR等信号通路增强了邻近肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力，促进肿瘤的侵袭和进展[13]；④肿瘤组织中lncRNA H19的高表达能够降低肿瘤细胞对紫杉醇、替莫唑胺等化疗药物的敏感性，从而对患者的生存期产生不良影响[14，15]。但上述结论均源自针对其它种类恶性肿瘤的研究结果，lncRNA H19高表达导致PCa不良预后的确切机制仍需要进一步的基础医学研究予以证实和讨论。

综上所述，PCa癌组织中存在lncRNA H19相对表达量上调，其表达水平与肿瘤的病理特征和患者的预后具有相关性，可作为预测患者预后的辅助指标和潜在治疗靶点，患者术前血清PSA水平虽与病理特征具有相关性，但其水平受到多种因素影响，与患者的预后缺乏相关性。