ZnO 表面改性Zn-Cu 组织工程支架的研究

任浩征，潘超，许迎，孙小淏，刘德宝

（天津理工大学 材料科学与工程学院，天津 300384）

近年来，具有生物可降解特性的新一代医用金属材料的研究发展迅速，这类新型医用金属材料（Mg、Fe、Zn）巧妙地应用在人体环境中，充分利用其易发生腐蚀降解的特性，实现在体内逐渐降解直至最终消失的医学临床目的[1-7]。因此，可降解金属通过材料成分的合理设计，结合生命科学和工程学的研究思路，将会对骨组织工程学产生积极而深远的影响。

可降解镁合金材料因表现出优异的生物相容性而被广泛研究。Mg 大量参与人体的各种生理活动，在许多细胞功能中发挥着重要作用[8]，且其密度与人体骨骼密度接近，同时弹性模量也与人体骨骼相近，减少了应力屏蔽[9]。Singh 等人[10]采用粉末冶金以及钛编织丝网作为空间支撑材料相结合的方法，成功地制备了一种孔隙率为60%、孔径大小约为300 μm、孔洞互连的新型Mg-10Zn-4Y 支架材料。其中，钛编织金属丝网法保证了拓扑有序多孔结构的形成；锌和钇作为添加的合金材料，通过提高整体可烧结性来增强多孔镁的强度；使用L929 细胞对支架材料的细胞相容性进行了研究，证实了其生物相容性良好。然而，Mg 的标准电极电位为-2.37 V，因此，镁在生理环境中的腐蚀速率快，并且在腐蚀过程中会产生氢气包囊[11]。应用到组织工程领域的镁基多孔支架由于具有更大的表面积，因而腐蚀降解速率会更快。可降解铁基材料有较好的生物相容性。Fe 是人体必需的金属元素，参与氧的运输与储存，与某些酶的合成和活动密切相关[12]。Carluccio 等人[13]采用选择性激光熔化（SLM）制备了孔隙率为42%的Fe-35Mn 骨支架，并对其性能进行了深入分析，结果表明，选择性激光熔化可以制备具有复杂分级结构的材料，这是传统制造方法无法实现的；支架的微观结构主要由奥氏体组成，延展性良好；电化学和浸泡测试体现出Fe-35Mn 支架降解速率比纯铁快；植入大鼠颅骨4 周后观察到新骨形成，表明该支架具有良好的生物相容性。然而，Fe的标准电极电位为-0.44 V，在体内的腐蚀降解速率较慢，铁基多孔支架如若植入到体内会有较长时间的保留。此外，铁的腐蚀产物在生理环境中趋于稳定，导致长期滞留，这可能会引起代谢并发症[14-15]。另外，铁基材料本身具有铁磁性，在植入后的医学影像检测中存在诸多不便。

锌具有良好的生物相容性，标准电极电位为-0.76 V，介于镁和铁之间，降解速率适中。Xiao 等人[16]对Zn-0.05Mg 合金进行了体内外研究。结果表明，在纯锌基础上添加镁以后，力学性能得到了改善；合金对L-929 细胞无毒性作用，且对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有抗菌作用；将Zn-0.05Mg 植入兔股骨后均匀降解且无炎症反应，在骨与植入体界面逐渐有新骨形成。目前，对于锌基多孔支架的研究也在不断深入[17-23]。Capek 等人[18]采用放电等离子烧结制备了孔隙率约为20%的多孔Zn。结果表明，初始Zn 粉末尺寸显著影响孔的大小和形状、机械性能以及腐蚀性能；浸泡实验证明多孔Zn 表面可以沉积Ca-P 产物，具有良好的生物活性。Xie 等人[19]采用气压渗流法制备了孔隙率为59.1%的多孔Zn-1Ag、Zn-3.5Ag 支架。结果表明，降解表面的腐蚀产物主要由ZnO、Ca3(PO4)2和Zn(OH)2组成；多孔Zn-Ag 支架的力学性能高于相同孔隙率的多孔Zn 支架，说明合金元素的添加改善了支架的力学性能；随着银含量的增加，多孔锌银支架的抗菌能力越来越高。Cockerill 等人[20]采用增材制造技术制备了孔径为900 μm 和2 mm 的锌骨支架，制备的多孔锌支架呈现出完全互连的孔结构，可促进细胞渗透和骨向内生长，且表现出良好的抗菌作用；体外细胞测试和浸泡结果，证实了支架良好的生物相容性和适中的降解速率。上述研究都证明了锌基多孔支架在骨科领域具有良好的应用前景。

为了获得综合性能优异的锌基多孔支架，对其进行合金化是很有必要的。铜是锌合金的主要合金化元素之一，也是人体必需的微量元素，可改善机械性能和生物医学功能，如增强锌基多孔支架的力学性能和抗菌效果[24-26]。Hou 等人[25]采用热压烧结来制备氯化钠模板，将熔化的金属渗流到氯化钠模板中，凝固后去除氯化钠，得到多孔纯Zn 和Zn-3Cu 支架。由于铜在锌基体中的固溶和锌铜第二相的析出，添加铜显著提高了锌支架的力学性能和腐蚀速率。Tang 等人[26]系统研究了挤压态Zn-xCu（x=1,2,3,4）合金的显微组织、力学性能、细胞毒性和抗菌性能。结果表明，Zn-Cu二元合金具有良好的强度和延展性、可接受的细胞毒性和良好的抗菌性能。此外，由于人体细胞存在于组织液中，组织液以水溶液为基础，支架材料优良的亲水性能有利于组织液浸润，也有利于促进细胞的快速粘附和快速生长[27-28]。在医用金属材料表面改性的研究中发现，在Ti 基体表面制备了Hep/ Chi 功能涂层，在Mg 基体表面制备了PDA/HA 功能涂层，改善了表面的润湿性，显著地提高了材料的生物相容性[29]。在Zn-Cu 组织工程支架表面进行ZnO 表面修饰可改善支架表面润湿性，促进亲水性，且ZnO 也具备一定的抗菌作用[30-31]，对Zn-Cu 组织工程支架进行ZnO表面修饰，有望达成ZnO 与富铜相的协同抗菌作用，进一步提高Zn-Cu 组织工程支架的抑菌、抗菌性能。在合金支架表面制备ZnO 的方法有固相法、气相法和液相法。固相法在反应中会引入杂质粒子，气相法的制备过程较复杂。液相法效率高，成本较低，其中水热法制备ZnO 过程相对简单，易于控制，速度快且制备的ZnO 形貌可控均匀。所以，水热法是目前制备ZnO 最常见的方法[32]。

在本研究中，利用气压渗流铸造法制备出理论孔隙率为60%且孔径尺寸为100～500 μm 的Zn-xCu（x=0,1,2,3）合金组织工程支架。通过水热法对Zn-Cu组织工程支架进行ZnO 表面修饰，从而改善其表面润湿性。对所制备支架的宏观、微观形貌，ZnO 表面修饰后支架表面的微观形貌、相结构以及表面亲水性能进行了系统表征，并且评价了ZnO 表面修饰后的Zn-Cu 组织工程支架的抑菌、抗菌性能。本研究可以对开发新一代Zn 基组织工程支架材料提供借鉴与参考。

1 试验

1.1 材料制备方法

1.1.1 Zn-Cu 支架的制备

本研究中制备Zn-Cu 合金组织工程支架所用的材料包括高纯锌锭（纯度99.995%）、高纯铜粉（纯度99.99%）、50～100 目NaCl 颗粒。Zn-Cu 合金组织工程支架的制备采用气压渗流铸造法，其铸造模具示意图如图1 所示。具体制备步骤为：首先在坩埚中将锌锭加热至560 ℃，保温1 h，之后将配比好的铜粉加入坩埚，继续保温1 h，在此过程中通入N2作为保护气氛；将氯化钠颗粒放入模具中，一起放入电阻炉中330 ℃保温至浇铸；然后迅速将熔融好的合金撇渣后浇铸到模具中，冷却后脱模；在超声环境中清洗去除氯化钠颗粒，得到锌铜合金支架。

图1 铸造模具示意图 Fig.1 Schematic diagram of the casting mould

1.1.2 表面ZnO 涂层的制备

将Zn-Cu 合金组织工程支架采用线切割的方法加工成φ10 mm×3 mm 圆柱体试样，用去离子水、无水乙醇超声清洗，然后充分干燥。将干燥后的试样置于200 g/L 的氯化钠溶液中，在80 ℃下保温5 h。到预定时间后，取出试样放置到真空干燥箱中充分干燥。

1.2 显微形貌观察与物相分析方法

使用场发射扫描电子显微镜（FE-SEM, Quanta FEG 250）对φ10 mm×3 mm 的Zn-Cu 支架圆柱体试样进行显微形貌观察。使用场发射扫描电子显微镜对φ10 mm×3 mm 的表面制备有ZnO 层的圆柱体试样进行显微形貌观察。使用X 射线衍射仪（XRD，Rigaku D/max/2500PC），在扫描范围2θ 为10°～80°、扫描速度为5 (°)/min 的条件下，对表面制备有ZnO 层的圆柱体试样进行物相分析。

1.3 Zn-Cu 支架表面接触角测定方法

材料表面与水的接触角采用光学接触角测量仪进行测量。将平整的待测试样放置在实验台上，然后通过滴定针管将5 μL 去离子水滴在样品表面，用相机拍摄液滴与样品表面接触图像，最后经图像分析得到材料与水的接触角。

1.4 ZnO 表面修饰前后的Zn-3Cu 支架细胞粘附性能评价

对ZnO 表面修饰前后的Zn-3Cu 合金组织工程支架的细胞粘附性能进行评价。将MC3T3 大鼠成骨细胞置于α-MEM 培养基中，在37 ℃、5%CO2条件下的培养箱中培养6 h，将Zn-3Cu 合金组织工程支架辐照灭菌之后，每片材料接种相同数量的细胞，用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗掉残留的培养基，之后用Hoechst染色剂染色细胞核20 min，最后用激光扫描共聚焦显微镜（LSCM，Nikon A 1）观察细胞的粘附情况。

1.5 ZnO 表面修饰前后的Zn-3Cu 支架抗菌性能评价

评价材料抑菌、抗菌性能所用菌种为金黄色葡萄球菌与大肠杆菌。将金黄色葡萄球菌置于LB 液体培养基中培养，将培养好的细菌悬液接种于平板，充分涂抹，将ZnO 表面修饰前后的Zn-3Cu 支架小圆片贴于平板中间，16 h 后观察测定材料周边抑菌圈的大小，抑菌圈越大，材料的抑菌抗菌性能越好。

将大肠杆菌置于LB 琼脂培养基中培养，将配制好的有ZnO 表面修饰的Zn-3Cu 支架材料浸提液涂于此培养基上，干燥后将培养好的细菌悬液分别涂布与划线，16 h 后与空白试样形成对照，观察细菌数量的变化情况。细菌数量若减少，进一步证明ZnO 表面修饰后的Zn-3Cu 支架材料具有抗菌性能。

2 结果及分析

2.1 Zn-Cu 支架的微观形貌

本研究制备的Zn-3Cu 合金组织工程支架的宏观和微观形貌如图2 所示。计算分析得出支架的平均孔径尺寸为237 μm，实际孔隙率为(71.13±0.90)%。从图2a 中的宏观形貌照片可以看出，支架材料底面和侧面的孔洞均匀分布。以图2b 中的SEM 照片可看出，支架体孔洞分布均匀，孔的连通性良好，孔洞之间的孔壁相对完整。

图2 Zn-3Cu 合金组织工程支架形貌 Fig.2 Zn-3Cu alloy tissue engineering scaffolds: a) macrostructures; b) scanning electron microscope (SEM) image

2.2 ZnO 表面修饰的Zn-Cu 支架表面微观形貌及相组成

Zn-Cu 合金组织工程支架表面ZnO 层的微观形貌如图3 所示。可以看出，在同一温度、相同时间的处理条件下，在纯锌支架体表面，ZnO 多为一些絮状颗粒。 添加Cu 合金元素的Zn-xCu（x=1,2,3）支架表面均被针状或者棒状聚集的团簇均匀覆盖，并且随着Cu 添加量的增加，支架表面针状、棒状ZnO 的大小逐渐变大。图4 为带涂层支架体表面XRD 相结构分析谱图。从图4 中可以发现，支架体表面有Zn、CuZn5、ZnO 相，说明经过改性后的材料表面生成了棒状、针状的ZnO 产物。

图3 Zn-Cu 合金组织工程支架表面修饰后的微观形貌 Fig.3 Microstructures of coated Zn-Cu alloy tissue engineering scaffolds

图4 支架体表面修饰后的XRD 相结构分析图谱 Fig.4 XRD phase structure analysis of coated scaffolds surface

从图3 可以看出，相同水热反应条件下，纯锌支架体表面生成的ZnO 为颗粒状，处于生长的初级阶段，有逐渐形成与长大的趋势。而添加Cu 以后，由XRD 相结构分析可知，Zn-2Cu、Zn-3Cu 支架体表面会有金属间化合物CuZn5相的形成，并且随着Cu 添加量的增加，CuZn5相的含量也增加。基体Zn 的腐蚀电位低于第二相CuZn5相的腐蚀电位，二者之间会形成腐蚀微电池，Zn 在Zn-Cu 合金中充当阳极，发生电偶腐蚀[26]，锌基体的腐蚀速率显著增加，Zn 离子释放量增加，从而使ZnO 晶体的生成与长大速率变快，因此随着合金元素Cu 含量的增加，Zn-Cu 支架材料表面生成的ZnO 晶体尺寸逐渐增加。

Zn-Cu 合金组织工程支架在80 ℃的NaCl 溶液中生成ZnO 相的反应方程式如(1)—(3)所列[33-35]。

支架置于NaCl 溶液后，锌的溶解和氧的还原开始进行，Zn2+和OH-通过扩散作用相互接触，反应生 成Zn(OH)2，再进一步转化为ZnO，当ZnO 在NaCl 溶液中的浓度达到过饱和时，则会在试样表面逐渐沉积。虽然ZnO 层在Cl-的作用下会发生分解生成可溶性物质ZnCl2[36]，但依据表面均被ZnO 层均匀覆盖的实验结果可以推断，ZnO 层的沉积速率大于其分解速率。其原因可能是NaCl 电解质溶液具有良好的导电性，加速了锌的溶解和氧的还原过程的进行。此外，试样附近溶液中的OH-会随着反应的进行而逐渐增多，pH 值进而大于7，溶液呈碱性，而ZnO 易于在碱性环境中稳定存在。制备的ZnO 纳米棒大多呈现六棱柱形态。六棱柱ZnO 的生长过程主要包括三个阶段[37]：

1）六方薄片的形成。Zn2+与OH-发生反应生成ZnO，为降低表面能，ZnO 聚集在一起形成六方薄片。

2）二维方向形核。在低能量的{0001}晶面族上不断形成新晶核，溶液中Zn2+与OH-数量逐渐增多，ZnO 二维形核速率也相应变快。

3）晶核侧向长大。晶核将主要沿二维方向侧向长大，以降低晶核六个侧面的高表面能。随着不断的形核与长大，ZnO 六方薄片逐层生长并最终生长为六棱柱ZnO 纳米棒。

2.3 ZnO 表面修饰对Zn-Cu 支架表面接触角的影响

图5 ZnO 表面修饰前后的Zn-Cu 合金组织工程支架接触角测定结果 Fig.5 Water contact angles of the surface of Zn-Cu alloy tissue engineering scaffolds with or without ZnO coating

Zn-Cu 合金组织工程支架和ZnO 表面改性的Zn-Cu 合金组织工程支架的接触角测试结果如图5 所示。从图5 中可以看出，表面没有制备ZnO 层的Zn-Cu支架对水的接触角均为90°～180°，即水对材料均表现为不润湿。而ZnO 表面改性的Zn-Cu 合金组织工程支架表面接触角则表现出明显差异：纯锌支架的接触角为112.21°，大于90°，表现为不润湿，即纯锌支架经5 h 的水热处理后，表面涂层并不能够改善其润湿性。这可能是因为纯锌支架为纯金属，成分单一，制备 的表面ZnO 层厚度较薄、局部覆盖，造成对水的吸引力较弱。Zn-1Cu、Zn-2Cu、Zn-3Cu 支架材料表面的接触角分别为46.44°、46.48°、0°，均小于90°，都表现为润湿。结合ZnO 的尺寸和形貌，Zn-Cu 材料表面的ZnO 多生长为针状或者棒状，且形态多为聚集的团簇，导致表面的粗糙度变大，对水的吸引力变大，接触角变小。Zn-3Cu 支架材料表面的ZnO 分布均匀且相对致密，粗糙度较大，对水的吸引力较强，润湿效果最佳，表现为完全润湿。材料表面与水的接触角大小可以显示出材料表面润湿性的差异[38-39]，通过测定材料表面对水的接触角可反映支架材料表面的亲疏水性能。接触角越小，代表材料的亲水性能越好，有利于组织液的浸润，从而促进细胞快速粘附；相反，接触角越大，表示支架材料表面的润湿性越差，越不利于组织液的浸润，从而减缓细胞在支架表面粘附。

2.4 ZnO 表面修饰对Zn-Cu 支架细胞粘附性的影响

图6 Zn-3Cu 合金组织工程支架细胞粘附 Fig.6 Cell adhesion on Zn-3Cu alloy tissue engineering scaffolds: a) without ZnO coating, b) with ZnO coating

结合Zn-Cu 合金组织工程支架的接触角大小，说明了材料表面的ZnO 能够改善材料的亲水性，促进了细胞在组织工程支架表面的快速粘附，从而实现支架材料表面功能化，对于组织工程支架的临床应用十分有意义。

2.5 ZnO 表面修饰前后的Zn-3Cu 支架抗菌性能评价

图7 为未经ZnO 表面修饰和ZnO 表面修饰后的Zn-3Cu 支架与金黄色葡萄球菌接触培养16 h 后的细菌菌落铺板数码照片。从图7 中可以看出，未经ZnO表面修饰的Zn-3Cu 合金支架有效灭菌空白区域的最长距离为7.8 mm，说明其合金本身Zn-3Cu 材料存在抗菌活性，ZnO 表面修饰后的Zn-3Cu 合金支架有效灭菌空白区域的最长距离为9.8 mm，说明ZnO 表面修饰后的Zn-3Cu 合金支架的抑菌、抗菌效果优于未经ZnO 表面修饰的Zn-3Cu 合金支架。图7 中没有完整抑菌环的存在，可能是因为微观孔隙结构存在毛细现象，孔与孔之间的结构存在差异，合适的孔结构对菌落有一定的吸附作用，从而会有一部分菌落贴附于材料周围，导致抑菌环不完整。

图7 Zn-3Cu 合金组织工程支架抑菌圈照片 Fig.7 Antibacterial circle photograph of Zn-3Cu alloy tissue engineering scaffolds: a) without ZnO coating; b) with ZnO coating

图8、图9 分别为菌液划线图与涂布图。图8a与图9a 为空白菌液，图8b 与图9b 为ZnO 表面修饰后的Zn-3Cu 支架浸提液与大肠杆菌共培养后的菌液。可以看出，分别将菌液划线与涂布后，作为空白对照的菌落生长状态良好，菌落与菌落之间致密紧凑排列，稠密分布，肉眼无法分辨出菌落状态；而Zn-3Cu 支架材料浸提液处理过的菌液与空白菌液相 比，菌落数量减少，清晰可见点状细菌菌落，分布稀疏，松散排列。这进一步说明了ZnO 表面修饰后的Zn-3Cu 支架材料具有抑菌、抗菌性能。

图8 Zn-3Cu 合金组织工程支架抑菌划线照片 Fig.8 Antibacterial line photograph of Zn-3Cu alloy tissue engineering scaffolds: a) blank; b) with ZnO coating

细菌细胞壁和细胞膜会被ZnO 颗粒溶解释放的Zn2+破坏，导致细菌内容物流出，从而严重抑制其活性，最终导致细菌死亡。并且有研究发现，ZnO 中溶解的Zn2+的质量浓度约为10 μg/mL 时，细胞活性降低到50%[40]。除Zn2+的作用外，ZnO 颗粒对细胞的机械损伤也可导致其抑菌、抗菌。细菌的细胞表面存在羧基等一些带负电荷的基团，ZnO 纳米颗粒带正电荷，在静电力的作用下，细菌细胞与ZnO 颗粒相互吸引，紧密结合，针状或者棒状聚集的团簇ZnO 对细菌细胞壁和细胞膜造成破坏，从而使细菌失去活性[41]。此外，ZnO 颗粒的取向也能影响其抗菌性能，随机取向的ZnO 颗粒的抗菌效果优于规则取向的ZnO 颗粒[42]。

图9 Zn-3Cu 合金组织工程支架抑菌涂布照片 Fig.9 Antibacterial coated photograph of Zn-3Cu alloy tissue engineering scaffolds: a) blank; b) with ZnO coating

3 结论

1）制备的Zn-xCu（x=0,1,2,3）支架体孔洞分布均匀，连通性良好。

2）ZnO 表面修饰后的Zn-Cu 组织工程支架的表面润湿性得到改善，有利于细胞快速粘附，提高了支架材料的细胞相容性。

3）ZnO 表面修饰后的Zn-Cu 组织工程支架具有良好的抑菌、抗菌性能。