不锈钢罐孵育系统对绵羊胚胎体外发育效果的影响

郭延华，周 平，王立民，王新华，刘守仁，皮文辉

(绵羊遗传改良与健康养殖国家重点实验室/新疆农垦科学院，新疆 石河子 832000)

哺乳动物卵母细胞和早期胚胎对环境应激非常敏感。 胚胎培养实验室内，关键设备之一是二氧化碳培养箱，配子/胚胎体外培养的大部分时间处于培养箱内。 培养箱的主要功能是为配子和胚胎发育提供稳定的环境。 为了达到这个目标，培养箱调节温度、二氧化碳水平、pH 值、氧气浓度和湿度/蒸发/介质渗透压；所有这些都会影响胚胎发育[1]。 大多数可用的二氧化碳培养箱内部面积很大，而且日常工作需要频繁开门，会扰乱箱内平衡，降低培养系统的稳定性。

为了保持单元内的环境稳定，多数实验室采用个人专用培养箱，减少分享空间，降低培养箱开门次数。 这样做法降低设备利用效率，增加固定资产投资。

Vajta 等(1997)报道潜水艇孵育系统。 将含有胚胎的组织培养皿单独包裹在不渗透二氧化碳、氧气和氮气的层压箔袋中，并填充所需的气体混合物，然后热熔封闭，浸入循环控温水浴中，以达到所需的培养期(最长7 d)。这样，所有包装好的培养皿都可以作为单独的培养箱(“潜艇”)使用。该系统的优点是温度、湿度和气体混合物稳定；打开后这些参数可快速恢复；灵活使用不同的混合气体；安全；成本低；降低污染风险；清洁问题少；运输方便[2,3]。

本文利用实验室二氧化碳传感器坏了的培养箱做恒温容器，将含有早期胚胎的组织培养皿单独放在1 L 的304 不锈钢压力罐中，并填充饱和湿度的标准混合气体，关闭开关，密闭压力罐，放入恒温箱中，达到所需要的培养期7 d。该孵育系统创造的培养单元内环境稳定，每一个罐子都可以作为单独的培养单元使用，具有潜水艇孵育系统表现出来的优点。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

卵母细胞体外成熟TCM199 试剂购自Gibco 公司。 体外操作液 (H199)、 早期胚胎体外培养发育液(SOFaai: NaCL 107.70 mM, KCL 7.15 mM, NaHCO325.00 mM, KH2PO40.30 mM, Na Lactate 3.32 mM,pyruvate 0.33 mM, CaCL2*2H2O 1.71 mM, Myo-inositol 2.77 mM, GlutaMAXTM1 mM, MEM non-essential amino acids 100×, Basal medium Eagles essential amino acids 50×, Gentamicin 50 mg/L, fatty acid free BSA 8 mg/mL)、电融合液和激活液(SOFaai+7%乙醇和SOFaai+2 μmoL/L 6-DMAP)均自配[4]。

1.2 实验材料

1 L 304 不锈钢压力罐购自苏州瑞祥电子商铺。MIC-101 培养系统(Billups-rothenberg，世联博研)，每个培养室的体积大约为8 L。 Heraeus 二氧化碳培养箱，该培养箱二氧化碳检测器坏了，联系厂家客服，反馈信息是该型号太古老，已经停产，无法匹配对应的二氧化碳检测器，由于控温系统正常，因此在实验室当恒温箱使用。5% CO2、7% O2和88% N2标准混合气体(上海伟创标准气体有限公司)。 绵羊卵巢取自当地活畜屠宰场。

1.3 试验方法

1.3.1 绵羊原代成纤维细胞饥饿培养

无菌操作取3 岁龄萨福克公羊耳部皮肤组织，清洗剪碎，培养于DMEM +10% FBS+双抗溶液中。 原代培养每隔3 d 换液1 次，5 d 后成纤维细胞生长至约90%，胰酶消化离心洗涤，用DMEM+10% FBS 的培养液进行传代培养，每3 d 换液1 次，传3 代冻存。 解冻细胞接种于24 孔板培养，长至80%时候，用PBS 清洗2 遍，换成2% FBS 的DMEM 培养液培养，每隔3 d 换液一次，饥饿培养至第6 d，胰酶消化，2 500 r/mim 离心收集至1.5 mL EP 管，100 μL 2% FBS 的DMEM 培养液重悬细胞以备供核。

1.3.2 绵羊体细胞克隆

新鲜卵巢组织置于约30 ℃生理盐水保温瓶中，在120 min 内运到实验室进行处理。卵巢在PBS 中清洗2 遍，放入含有60 IU/mL 肝素的Hepes 缓冲TCM-199 采卵液的培养皿中，用手术刀片切割卵巢表面的滤泡。 选择致密卵丘-卵母细胞复合体(COCs)，在Hepes 缓冲TCM-199 中洗涤2 遍。 每组50 个COCs在 400 μL NaHCO3缓冲 TCM-199 中成熟，TCM-199 成熟液中添加 10%(V:V) 胎牛血清 (FBS)、2 mM GlutaMAXTM、0.3 mM 丙酮酸钠、0.1 mM 半胱氨酸、5 μg/mL 促 卵泡激 素、5 μg/mL 黄体生成激素、1 μg/mL β-雌二醇，并将其置于38.6 ℃的5% CO2饱和湿度的培养箱中培养。

COCs 成熟21～22 h，在含1 mg/mL 透明质酸酶的Hepes 缓冲TCM-199 中去除卵丘细胞。 所有剩余的操作都在38 ℃的热板上进行。 挑选第一极体排出的优质成熟卵母细胞备用。 在60 mm 培养皿内制作操作液滴 (M199+25 mmoL/L Hepes+20% FBS+7.5 μg/mL CB) 并覆盖石蜡油。 去核和注核在显微操作台上进行。 重构的卵母细胞-供核细胞复合体在成熟液中培养30 min ；然后在融合液(0.3 moL/L 甘露醇+0.5 mmoL/L Hepes+0.1 mmoL/L CaCl2+0.1 mmoL/L MgCl2)中进行电融合，条件为直流脉冲场强25 kV/cm、时程20 μs、次数2 次。 电融合每批5～8 枚/次。 卵子/供核细胞复合体电融合后培养45 min 观察融合情况， 剔除没有融合的复合体。 重构胚继续培养2 h 进行激活处理，7%乙醇7 min、2 μmoL/L 6-DMAP 4 h激活。 清洗重构胚后，转入平衡好的发育液SOFaai 中。 含有重构胚的培养皿放于培养罐(1 L 304 不锈钢压力罐或MIC-101 培养系统)内，充入经过蒸馏水的混合标气(5% CO2、7% O2和88% N2)。 充气后密闭罐子，置于38.6 ℃恒温箱中培养，第7 d 取出打开罐子，检查囊胚率。

1.3.3 孤雌胚胎的制作

将成熟24 h 去除颗粒细胞的卵母细胞，用7%乙醇7 min、2 μmoL/L 6-DMAP 4 h 进行激活处理。 然后移入 SOFaai 清洗 3 遍。 将孤雌胚胎置于平衡好的发育液 SOFaai 中，38.6 ℃、5% CO2、7% O2和 88% N2饱和湿度的密封培养罐(1 L 304 不锈钢压力罐或MIC-101 培养系统)培养，培养第7 d 检查囊胚率。

1.4 统计分析

试验数据采用卡方 (X2) 检验分析，P＜0.05 为差异显著。

2 结果与分析

2.1 孤雌激活胚胎体外发育结果

2020 年7 月采集屠宰场绵羊卵巢获取卵母细胞，卵母细胞成熟后孤雌激活，获得的孤雌激活胚胎培养于不同的培养罐中，通过第7 d 的囊胚率，确定不同培养罐对孤雌激活胚胎体外发育的影响。 3 个重复共308 枚孤雌激活胚胎发育结果见表1。结果表明，在304 不锈钢罐和MIC-101 培养系统内培养，孤雌激活胚的囊胚发育率没有差异(26.45% vs 24.84%，P＞0.05)。

表1 不同孵育器对孤雌胚胎体外发育的影响

2.2 克隆重构胚胎体外发育结果

2020 年10 月采集屠宰场绵羊卵巢获取卵母细胞，卵母细胞成熟21～22 h，经去核、注核和激活处理后，获得的重构胚胎培养于不同的培养罐中，通过第7 d 的囊胚率，确定不同培养罐对重构胚胎体外发育的影响。4 个重复共948 枚重构胚胎发育结果见表2。结果表明，304 不锈钢罐和MIC-101 培养系统中，克隆重构胚的囊胚发育率没有差异(16.07% vs 16.84%，P＞0.05)。

表2 不同孵育器对重构胚体外发育的影响

在体式显微镜下观察，两个培养系统中囊胚形态、内细胞团和孵化效果没有差异(见图1)，初步说明MIC-101 和304 不锈钢罐孵育系统材质都能满足早期胚胎体外培养需求。图1 是用手机在体视镜目镜中拍摄的照片。

图1 重构胚在不同孵育器内的发育

3 讨 论

几乎所有被调查物种的输卵管和子宫中的氧气浓度都明显低于大气中的氧气浓度(分别为1.5%～6%和21%)[5]。 牛[6]、猪[7]和绵羊[8]早期胚胎体外培养使用简单的培养基(非共培养体系)，在低氧(5%～8%)环境下培养同大气环境下比较，发育效果和囊胚质量更优，改善了胚胎妊娠率。低氧浓度应该是包括人类在内的所有哺乳动物胚胎培养系统的原则[9]，而且全球基本形成共识[5]。

MIC-101 培养系统(见图2)已经被许多实验室采用，进行细胞、胚胎或其它生物体培养，创造了实验所需的气象环境，气体浓度保持恒定，湿度不变，培养皿也与潜在的污染物隔离。 MIC-101 允许在预定的确切条件下进行实验。 可以根据需要改变气体浓度、湿度或温度，使用方便。

304 不锈钢罐(见图2)材质同多数二氧化碳培养箱不锈钢内套一样，所以材质方面满足胚胎培养。实验中使用的1 L 304 不锈钢罐，单价300 元左右，价格便宜。 腔体1 L，较MIC-101 系统更小(约8 L)，使用时节省标准混合气体，占用恒温箱内部的空间更小，提高实验室设备利用率。 在一个封闭的系统中，50 mL 的混合气体可以满足200 枚牛胚胎从受精卵到囊胚期7 d 的需要[2]。 因此，如果只进行胚胎培养，可以采用更小体积的不锈钢罐。

不锈钢罐与MIC-101 或层压箔袋相比，可以承受一定的压力。 压力造成胚胎应激，适宜的应激可能改善胚胎质量[10]。 因此，用304 不锈钢罐作为早期胚胎培养的孵育器，可以为研究压力对胚胎体外发育的影响提供装置基础。

图2 两种孵育器实物图

4 结 论

本实验结果表明，在5% CO2、7% O2、88% N2标准混合气体、饱和湿度和38.6 ℃环境条件下，不锈钢罐孵育器和MIC-101 孵育器比较，孤雌激活胚胎的囊胚发育率26.45% vs 24.84%；重构胚胎的囊胚发育率16.07% vs 16.84%，差异都不显著(P＞0.05)。 说明304 不锈钢罐组合标准混合气体和恒温箱，是一种价格便宜、易用、环境稳定的早期胚胎体外培养孵育系统。