大豆多糖固体碱催化剂脱酯效果影响因素

刘少聪， 何志勇， 曾茂茂， 王召君， 陈 洁

（食品科学与技术国家重点实验室，江南大学，江苏 无锡 214122）

水 溶 性 大 豆 多 糖 （soluble soybean polysaccharides，SSPS） 是从豆粕中脱去蛋白质后的豆渣中提取出来的一种水溶性阴离子多糖[1]。 SSPS结构类似果胶，主链由聚鼠李糖半乳糖醛酸（RG）和聚半乳糖醛酸（GN）组合而成。与果胶的结构不同之处在于，SSPS 是一种短主链、长侧链的结构，在水溶液中呈现梳子状或者球状形态，而果胶则是长主链短支链结构[2]。相关研究表明，SSPS 独特的结构使其具有在酸性条件下稳定蛋白质的能力、具有良好的乳化性和起泡性、抗淀粉黏结以及成膜性等功能特性，同时由于大豆多糖的低黏度特征使其具有清爽的口感，这些特征使大豆多糖在食品行业中具有巨大的应用潜力[3-4]。

SSPS 的性质与其结构相关，尤其是于其酯化度和相对分子质量、相对分子质量分布相关。 在天然的SSPS 分子结构中，D-半乳糖醛酸基团的C-6 位置被甲氧基取代[2]，酯化度（DE）一般超过70%。目前的研究显示，DE 值越大，其在酸性条件下稳定蛋白质的能力越差[5]。 而对于乳化性和乳化稳定性而言，主峰相对分子质量较低的SSPS（30 000，以普鲁兰计），比相对分子质量更高（比如42 000 和56 000）的SSPS 乳化性和乳化稳定性更好[6]。

目前， 大分子多糖脱酯的方法主要有酸法、碱法和酶法等[7-9]。 但对于SSPS，由于缺乏有效的专一性脱酯酶[10]，而酸法容易造成多糖主链降解导致性能大幅度下降[7]，酸化和酶法脱甲酯效果很差，因此目前工业化脱甲酯的方法主要是碱法[8]。 但是，碱法脱酯工艺副反应很多，在脱酯过程中，容易发生美拉德反应并引起褐变和β-消去反应。 因此，碱法脱酯制备的大豆多糖需要增加后期脱色和纯化工艺，大大增加了生产成本，而且会产生污染，这些问题使得发展新型SSPS 脱酯工艺成为迫切需求。

金属氧化镁（MgO）是一种在工业中应用广泛的固体碱催化剂[11]。相对于一般的酸性、中性或者两性催化剂而言，MgO 表面广泛分布着碱性催化位点，这使得MgO 具有较强的碱性， 因此MgO 催化剂常被认为是具有潜力的固体碱催化剂，可以在众多强碱催化反应中发挥催化作用[12]，且固体催化剂具有很多优点，如催化活性高、选择性高，可以用于连续工业生产中[13]。作者前期研究结果显示，MgO 催化剂催化SSPS 脱酯有一定效果，产物色泽浅，显示副反应程度显著低于碱法脱酯反应。 固体碱MgO 催化SSPS 脱酯具有潜在商业价值，但迄今为止，碱法脱酯的影响因素以及机制等尚不十分清楚。

作者利用碱性催化剂MgO 催化脱甲酯来制备低酯SSPS，通过对SSPS 脱酯过程的影响因素，包括反应温度、时间和催化剂投料质量比对产物相对分子质量和相对分子质量分布、酯化度以及产物单糖等多糖结构特征的研究， 以期有效提高低酯SSPS的品质并降低SSPS 的生产成本，为国内SSPS 产业化提供重要的技术依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

商业未脱酯大豆多糖（简称SSPS0）：平顶山金晶生物科技有限公司产品；硝酸镁（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司产品；氨水（分析纯）：南京化学试剂有限公司产品；无水乙醇（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司产品。

1.2 实验仪器

分析天平：瑞士梅特勒-托利多公司产品；磁力搅拌器、SHB-Ⅲ 循环水式多用真空泵：郑州长城科工贸有限公司产品；马弗炉：英国卡博莱特·盖罗公司生产产品；DF-101S 集热式恒温加热磁力搅拌器：上海豫康科教仪器设备有限公司产品；高速离心机：德国 SIGMA 公司产品。

1.3 实验方法

1.3.1 固体碱催化剂MgO 的制备工艺参考文献[12]和[13]，并略做修改。 前期预实验结果显示，500℃烧制5 h 的MgO 具有较好催化效果，在此选择此条件获得的催化剂进行脱酯影响因素研究。 用纯水中配制质量分数1.25%硝酸镁溶液， 于搅拌状态下逐滴滴加氨水至溶液浑浊， 继续保持搅拌12～24 h后抽滤，得到的固体部分置于500 ℃下焙烧5 h，得到固体碱催化剂MgO，磨碎备用。

1.3.2 催化剂MgO 脱甲酯工艺条件对SSPS 脱甲酯效果影响称取2.5 g SSPS0， 用 60 ℃温水配制质量分数5.0%溶液；将50 mL 溶液至于耐压瓶，按照催化剂投料质量比 1∶2、1∶5、1∶10、1∶25 和 1∶100 分别添加催化剂， 利用磁力搅拌器进行搅拌反应，反应温度分别设置为 80、90、95、100、105、110、120 ℃条件下加热搅拌，搅拌速度1 000 r/min；反应时间分别设置为 1、2、3、4、5、6、7 h 后， 将耐压瓶转移至冷水中终止反应； 反应液在5 500 r/min 离心15 min， 取上清液， 按体积比 1∶10 的比例加入无水乙醇，6 500 r/min 离心 15 min， 取沉淀，110 ℃下干燥20 min 后粉碎备用。

1.3.3 碱法 （NaOH） 脱甲酯工艺条件参考文献[8]，并略做修改。 称取 2.5 g SSPS0，用 60 ℃温水配制质量分数5.0%溶液； 利用0.1 mol/L NaOH 溶液将SSPS 溶液的pH 调至 12.5； 将溶液置于 95 ℃水浴中，反应4 h；向反应后的溶液中加入10 倍体积的无水乙醇；6 500 r/min 离心 20 min； 取沉淀，110℃干燥20 min；粉碎备测。

1.3.4 SSPS 相对分子质量的测定参考文献[14]并略做修改。 利用Waters2695+2414 色谱系统， 配备RI 示差折光检测器；TSK-gel G5000PWXL 色谱柱，柱温40 ℃；流动相为0.1 mol/L 磷酸盐缓冲液（pH＝6.8），流量为 0.6 mL/min；上样量 30 μL。根据液相色谱图谱进行数据分析，确定多糖相对分子质量。

1.3.5 SSPS 酯化度的测定参考文献[15]并略做修改。 5 g 待测样品加入20 mL 盐酸-乙醇混合液（5 mL 浓盐酸+40 mL 水+75 mL 无水乙醇）， 充分搅拌后，抽滤；采用上述盐酸-乙醇混合液洗涤反复洗涤5～8 次，再用体积分数 60%乙醇溶液洗涤 5～8 次，最后用无水乙醇洗涤5～8 次；洗净后将样品烘干。 准确称取0.5 g 上述洗净烘干的SSPS，加入0.8 mL 无水乙醇湿润，加入100 mL 去CO2水溶解样品，加入两滴酚酞指示剂，用0.1 mol/L 的NaOH 溶液进行滴定，此处消耗NaOH 溶液放的体积记为V1，即为样品的原始滴定度。 向样品中加入8.0 mL 0.5 mol/L的NaOH 溶液，剧烈震荡后静置30 min。 然后向样品中加入8.0 mL 0.5 mol/L 的HCl 溶液， 剧烈震荡后，再使用0.1 mol/L 的NaOH 溶液进行滴定，滴定至滴定终点，纪录消耗的0.1 mol/L 的NaOH 溶液体积V2，即为皂化滴定度。

式中：V1为样品的原始滴定度；V2为皂化滴定度。

1.3.6 SSPS 单糖组成测定参考文献[16]并略做修改。 配制 15 mg/L 的 SSPS 溶液， 准确取 200 μL SSPS 溶液于5 mL 具塞试管中，加入200 μL 4 mol/L的三氯乙酸（TFA）溶液，混合均匀后冲氮气（N2）3 min， 封管后置于 121 ℃烘箱中 2 h； 冷却后加入200 μL 甲醇，氮气吹干，重复加入甲醇并氮气吹干3～5 次； 将所得残渣用水定容至 10 mL 容量瓶，过0.22 μm 的微孔滤膜保存待测。 将所得样品利用色谱仪进行检测；色谱条件：色谱柱：3 mm×150 mm 阴离子交换色谱柱；流动相：A 相：超纯水，B 相：0.25 mol/L NaOH 溶液，C 相：1 mol/L 醋酸钠； 梯度洗脱（以体积分数计）：B 2%（0～22 min），B 2%～80%（22～23 min），B 80% （23 ～30 min），B 80% ～2% （30 ～31 min），B 2%（31～40 min）； 进样体积：20 μL； 流量：0.5 mL/min。 根据标准样品色谱图谱，计算样品中单糖组成与质量分数。

1.3.7 数据处理利用Excel 2010 版软件对数据进行分析。

2 结果与分析

2.1 反应温度对MgO 催化SSPS 脱酯效果的影响

反应温度是影响碱性固体催化剂催化过程最重要的因素之一[17]。为了探讨催化温度的影响，在固定底物SSPS 质量分数5.0%、催化剂MgO 投料质量比为1∶5 以及反应时间（4 h）条件下，将反应温度设置在80～120 ℃之间，每5 ℃一个间隔进行反应，反应结束后测定产物相对分子质量、酯化度以及单糖组成，结果见表1 和表2。

表1 反应温度对MgO 催化SSPS 脱酯产物相对分子质量及酯化度的影响Table 1 Effect of reaction temperature on the molecular weight and degree of esterification of SSPS catalyzed by MgO

表2 反应温度对MgO 催化SSPS 脱酯产物单糖组成的影响Table 2 Effect of reaction temperature on the monosaccharide composition of SSPS catalyzed by MgO

从表1 结果可以看出，利用MgO 催化SSPS 脱酯，随着反应温度升高，产物SSPS 的相对分子质量（Mw和 Mn）不断降低，酯化度也不断降低。 同时，产物的多分散性（PDI）也随着反应温度的升高而逐渐增加，这说明利用高温催化，不仅导致产物相对分子质量降低，更会使得产物均匀性下降，这可能对产物性质和应用不利。

相关文献[18]曾经报道，SSPS 的甲酯化度越低，其在酸性条件下稳定乳蛋白的能力越好；在甲酯化度25%以下时，SSPS 在酸性条件下稳定酪蛋白的能力可以与高酯果胶媲美[19]。值得注意的是，表1 结果显示， 利用碱性催化剂MgO 在催化剂投料质量比1∶5 以及反应时间 4 h 条件下催化 SSPS 脱甲酯，温度必须超过95 ℃，产物酯化度才能低于30%。

单糖组成可以有效判断SSPS 脱酯过程主链和侧链断裂的情况。 将各个温度段催化获得的产物进行单糖组成分析，结果如表2 所示。 SSPS 主链结构主要由聚鼠李糖半乳糖醛酸长链和聚半乳糖醛酸短链组成， 侧链主要为聚阿拉伯糖和聚半乳糖；其中聚半乳糖醛酸C-3 位点由部分木糖修饰，而侧链聚半乳糖可能存在中性糖修饰，包括岩藻糖、葡萄糖、木糖和阿拉伯糖等（如图1 所示）。 因此，从半乳糖醛酸与鼠李糖比例以及岩藻糖、葡萄糖等仅存在于聚半乳糖侧链上的中性糖的含量变化，可以推测催化过程SSPS 结构变化情况。 从表2 结果看出，半乳糖醛酸与鼠李糖比例先在80 ℃出现升高， 然后随着温度的升高逐渐降低，而葡萄糖残基几乎下降了90%，随后缓慢下降，而甘露糖和果糖残基在80℃催化时就直接降为零。结合表1 结果，脱酯过程相对分子质量迅速降低一半， 然后缓慢下降的情况，可以说明在80 ℃时脱酯时， 尽管主链断裂， 但是SSPS 的侧链中的中性糖残基易更被脱除，使得主链中的聚鼠李糖和半乳糖醛酸含量相对增加；随着脱酯温度不断升高，主链破坏不断加大，因此半乳糖醛酸与鼠李糖比例不断下降。 而半乳糖残基和阿拉伯糖残基比例不断上升结果也进一步说明， 利用MgO 催化SSPS 脱酯时，主链会受到破坏，侧链上中性糖也会被脱除，但聚阿拉伯糖和聚半乳糖侧链本身降解要比主链降解缓慢。

图1 SSPS 的结构示意图[2]Fig.1 Schematic diagram of SSP structure

2.2 催化剂MgO 的投料质量比对SSPS 脱酯效果的影响

投料质量比是影响碱性固体催化剂催化过程的重要因素之一[17]。 为了探讨催化剂投料比对催化过程的影响，在固定底物SSPS（质量分数5.0%）、反应温度（100 ℃）以及反应时间（4 h）条件下，分别催化剂投料质量比设置为 1∶2、1∶5、1∶10、1∶25 和 1∶100进行反应， 反应结束后测定产物相对分子质量、酯化度以及单糖组成，以探究投料比因素对MgO 脱酯效果的影响。 结果如表3 和4 所示。

从不同投料比条件下100 ℃反应4 h 的结果看，催化剂投料质量比从 1∶100 增加到 1∶5，酯化度显著下降， 但产物SSPS 的相对分子质量和多分散性变化相对比较小； 而进一步增加催化剂的投料比，产物的相对分子质量、多分散性和酯化度均变化很小。 这表明催化剂的添加量达到一定比例后，不改变反应温度或者时间， 不能进一步脱酯。 表3结果也说明， 在固定反应温度100 ℃反应4 h 的条件下，通过改变催化剂投料质量比，很难使SSPS 的酯化度低于27%。

表3 MgO 投料质量比对SSPS 脱酯产物相对分子质量及酯化度的影响Table 3 Effect of the ratio of MgO and SSPS on the molecular weight and degree of SSPS esterification

表4 MgO 投料质量比对SSPS 脱酯产物单糖组成的影响Table 4 Effect of the ratio of MgO and SSPS on the monosaccharide composition of SSPS

将不同催化剂投料质量比催化脱甲酯得到的SSPS 进行单糖组分分析（表4），可以看出，半乳糖醛酸和鼠李糖的含量随着催化剂的投料质量比的增加而逐渐升高，而葡萄糖残基在催化剂的投料质量比1∶100 时就几乎下降了90%， 甘露糖和果糖则直接降为零；半乳糖残基和阿拉伯糖残基投料质量比则随着催化剂比例的提升不断上升。 表3 结果趋势是， 在催化剂的投料质量比1∶100 时相对分子质量即下降了几乎一半， 随后催化剂量尽管上升，但相对分子质量下降缓慢。 表3 和4 的结果进一步说明利用MgO 催化SSPS 脱酯时， 不管催化剂多少，主链都会受到破坏， 且侧链上中性糖脱除更快，但聚阿拉伯糖和聚半乳糖侧链本身降解要比主链降解缓慢。 同时，上述结果也说明，固体碱MgO 催化SSPS 脱酯时，会破坏SSPS 的侧链和主链，但是单纯增加催化剂的量并不会导致脱酯过程中SSPS 结构的变化发生更大的改变，这与催化剂的添加量达到一定比例后，不改变反应温度或者时间，不能进一步降低产物酯化度是一致的。

2.3 反应时间对MgO 催化SSPS 脱酯效果的影响

反应时间也是影响碱性固体催化剂催化过程的重要因素之一[17]。 在固定SSPS 底物质量分数5.0%、 催化剂投料质量比1∶5 以及反应温度100 ℃条件下，将反应时间控制在 1、2、3、4、5、6、7 h，反应结束后测定产物相对分子质量、酯化度以及单糖组成，结果见表5 和表6。

从表5 可以看出，随着MgO 催化脱酯反应时间的延长，产物SSPS 的甲酯化度不断下降，多分散性也不断增加。 而且越到反应后期，酯化度下降越慢。在工业上，高温长时间反应是不经济的，因此该结果进一步暗示， 采用MgO 催化剂催化SSPS 脱甲酯， 要使产物甲酯化度降低到30%甚至25%以下，提升反应温度是更好的途径。

将不同反应时间催化脱甲酯得到的SSPS 进行单糖组分分析（表6），表6 结果与表5 非常一致，可以看出，随着反应时间延长，半乳糖醛酸与鼠李糖比例会先短暂增加， 然后在4 h 后半乳糖醛酸与鼠李糖比例变化很小，这与表5 相对分子质量变化是非常一致的；而中性糖侧链上的葡萄糖、甘露糖以及果糖等残基，反应1 h，就几乎脱除大半，4 h 后，各种糖残基含量变化都很小。 上述结果说明在100 ℃的条件下MgO 对SSPS 催化脱酯过程， 反应初期，例如1 h 以内，侧链中性糖残基脱落最快，主链断裂和脱酯几乎是同步的；随着反应时间延长，例如2～4 h 之间，主链断裂速度下降，而脱酯与部分在初期尚未脱除的中性糖不断进行；4 h 以后，所有反应都很缓慢。 聚阿拉伯糖和聚半乳糖侧链本身降解要比主链降解缓慢得多。

表5 MgO 催化反应时间对SSPS 脱酯产物相对分子质量及酯化度的影响Table 5 Effect of the reaction time of MgO on the molecular weight and degree of SSPS esterification

表6 MgO 催化反应时间对SSPS 脱酯产物单糖组成的影响Table 6 Effect of reaction time of MgO on the monosaccharide composition of SSPS

2.4 固体碱MgO 与纯碱对SSPS 脱甲酯效果的比较

如前所述，SSPS 脱甲酯， 目前工业上主要利用纯碱方法进行脱酯，由于pH 12 以下很难达到产物甲酯化度低于25%的要求，一般采用pH 12.0～12.5，温度70～95 ℃条件脱甲酯[20]。 之所以不采用更高温度脱甲酯， 是因为更高温度下美拉德反应非常严重，产物颜色过深，难以脱色，导致应用性很差[21]。

将纯碱脱酯与MgO 催化脱酯对甲酯化度以及产物相对分子质量进行比较， 探讨方法各自的特点。 在SSPS 质量分数为5.0%，MgO 投料质量比为1∶5 时，反应体系 pH 值为 10.5，结果如表7 所示。

表7 MgO 催化脱甲酯与碱法脱甲酯反应条件对SSPS 脱酯产物相对分子质量及酯化度的差异Table 7 Comparison of the molecular weight and degree of esterification for the MgO and NaOH catalytic reaction

在相同反应pH 条件下，同样在100 ℃反应4 h后，MgO 脱酯工艺与纯碱脱酯工艺相比， 产物在相对分子质量、相对分子质量分散性与酯化度方面均具有显著优势；而且pH 10.5 条件下，纯碱几乎无法达到酯化度低于30%的水平。 要使纯碱脱酯达到酯化度低于30%的水平，则pH 必须上升，这会带来产物颜色的显著恶化（如图2 所示）。 上述结果进一步证实，MgO 脱酯工艺与纯碱脱酯工艺相比， 在达到相似的酯化度前提下，MgO 脱酯工艺产物具有较高的相对分子质量，较低的多分散性以及更好的产物颜色，这使得MgO 脱酯产物在实际使用具有较大的优势。

3 结 语

在SSPS 的生产和研究中，SSPS 脱酯是一个重要环节， 一般酸法制备出的SSPS 产物具有较高的酯化度，不利于SSPS 在食品工业中的实际利用。 为此作者研究了利用固体碱MgO 催化高酯化度的SSPS 脱酯工艺条件对产物酯化度、相对分子质量和单糖组成等结构性质的影响。 结果显示固体碱MgO为催化剂对商业高甲氧基SSPS 进行脱酯， 底物质量分数5.0%，催化剂MgO 投料质量比在1∶5，反应温度100 ℃及以上，反应时间4 h 及以上，产物SSPS酯化度低于 30%，重均相对分子质量 Mw＞3×105。 与碱法脱酯工艺相比， 在达到相似的酯化度前提下，MgO 脱酯工艺产物具有更高的相对分子质量、更低的多分散性以及更好的产物颜色。 本研究为SSPS脱酯工艺提供了新的思路，MgO 脱酯工艺具有巨大的应用潜力。

图2 相同酯化度的MgO 催化脱甲酯产物与碱法脱甲酯产物的颜色Fig.2 Color of demethylation products catalyzed by MgO and bases with the same degree of esterification