UPLC法对大理州滇重楼的品质评价研究

管鑫，杨青淑，段宝忠,2，张海珠,2，夏从龙,2*

(1.大理大学药学与化学学院，云南 大理 671000；2.云南省高校滇西道地药材资源开发重点实验室，云南 大理671000)

0 引言

重楼为百合科重楼属植物(Paris L.)的总称，以“蚤休”之名始载于《神农本草经》。2015版《中国药典》收载了滇重楼Paris polyphylla Smith var. Yunnanensis(Franch.)Hand-Mazz.和七叶一枝花Paris. polyphyllaSmith var.chinensis(Franch.)Hara，以其地下根茎入药，具有清热解毒、消肿止痛、凉肝定惊等功效，是“云南白药”、“季胜德蛇药片”等著名中成药的主要原料[1-5]。该属植物主要含有甾体皂苷类、三萜类、黄酮类化合物，具有镇痛、止血、抗肿瘤、抑菌等活性[6,7]。

在李恒分类系统[8]下，重楼属共24个种，分布在欧亚大陆的热带及温带地区，我国有19种，分布较广，特别是在云南、贵州、四川等高海拔的西南省区种类最为丰富。其中，大理州有悠久的种药和用药传统，独特的民族文化为民族药业的发展奠定了深厚的基础，是云南省种植重楼等道地药材，发展“云药”产业的重要原料基地[7,9]，滇重楼又为药典收载的品种。因此，本实验对大理州滇重楼进行研究。由于重楼种子休眠时间长，生长过程也十分缓慢，从种子萌发到可作为药材收获一般需要较长时间。而重楼作为多种中成药的主要原料，需求市场远远大于供应市场，导致其供不应求，价格昂贵，近几年来甚至突破1000元/kg[7,9]。虽已有学者对重楼采收年限进行研究[12,13]，但尚未有大理区域内滇重楼的种植规化研究，因此，我们可以通过UPLC法对大理滇重楼根茎中5种重楼皂苷(Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ、H)进行含量测定，并对其进行分析比较，为探究大理滇重楼采收年限及种植区域规化提供一定参考依据。

1 材料

仪器：Agilent 1290 超高效液相色谱仪(美国Agilent有限公司公司)、超声波清洗机(SB25-12D型，宁波新芝生物科技股份有限公司)、分析电子天平、十万分之一电子天平(AL104型，梅特勒-托利多上海有限公司)、FY135型中草药粉碎机(永康市金穗机械制造厂)。

对照品与试剂：对照品重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅱ、重楼皂苷Ⅵ、重楼皂苷Ⅶ、(中国食品药品检定研究院，批号分别为111590-201604、111591-201604、111592-201604、111593-201604，纯度均达98%以上)，重楼皂苷H(北京融诚鑫德科技发展有限公司，批号分别为C-035-161001，纯度达98%以上)，色谱级乙腈，水为哇哈哈纯净水，其他试剂均为分析纯。

供试药材：9批(S1-S9)样品均为8年生重楼，来自大理州不同地区，5批(Y1～Y5)样品均采自大理永平基地，分别为5、6、7、9、10年生重楼，经大理大学药学与化学学院生药学教研室夏从龙教授鉴定为百合科(Lilliaceae)重楼属(Paris L.)滇重楼Paris polyphylla Smith var. Yunnanensis(Franch.)Hand-Mazz.，样品信息见表1。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备

精密称取各对照品0.0030g，加甲醇溶解后定容到10mL容量瓶中，摇匀，配成的对照品的浓度分别为重楼皂苷Ⅰ为0.3592g/L，重楼皂苷Ⅱ为0.3425g/L，重楼皂苷Ⅵ为0.3386g/L，重楼皂苷Ⅶ为0.3335g/L，重楼皂苷H为0.3288g/L。

2.2 供试品溶液的制备

将各供试药材粉碎，称取各供试药材0.5g，放入具塞锥形瓶中，加3mL甲醇后超声30min，重复三次，均取上清液过滤后用甲醇定容到10mL容量瓶中，摇匀，用时用0.22μm的微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.3 色谱条件

资生堂C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)，流动相乙腈(A)-水(B)梯度洗脱(0-2min，28%-30%A；2-9min，30%A-36%A;9-14min，36%A-39%A；14-19min，39%A-44%A；19-32min，44%A-50%A；32-50min，50%A)见表1，检测波长203nm，流速0.8mL·min-1，柱温25℃，进样量10µL。

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系考察

取对照品溶液分别进样1、2、4、6、8、10μL，在2.3色谱条件下，将图谱导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”得到重楼皂苷I 、II、VI、VII、H对照品峰面积。以对照品进样量(X)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，得到准曲线见表2。

2.4.2 精密度试验

取S1的供试品溶液，进样量为10μL，按上述色谱条件，连续进样6次，峰面积RSD均＜1.0%，表明此方法精密度较好。

2.4.3 重复性试验

取6份S1供试品溶液，按上述色谱条件，每次进样量为10μL，峰面积RSD均＜3%，表明该方法重复性较好。

2.4.4 加样回收率试验

取6份S1样品，每份约0.5g，分别加入重楼皂苷I、重楼皂苷II、重楼皂苷VI、重楼皂苷VII、重楼皂苷H，按上述方法制备，测得加样回收率为99.12%、98.88%、98.67%、98.22%、99.08%。且RSD为0.32%～0.95%。

2.5 结果与分析

2.5.1 大理州同产地不同生长年限滇重楼根茎主要皂苷类成分含量分析

大理州同产地(大理永平基地)分别为5、6、7、8、9、10年生滇重楼含量测定色谱图，见图1。不同年限滇重楼根茎中重楼皂苷I、II、VI、VII、H及2015版《中国药典》规定重楼皂苷I、II、VI、VII的总含量，见表3。结果显示，不同年限滇重楼根茎中均检测到2015版《中国药典》规定重楼皂苷I、II、VI、VII，其总含量范围在1.186～4.170%，均大于2015版《中国药典》规定的0.60%的质量控制标准，大理州不同生长年限滇重楼根茎中重楼皂苷的总含量总体呈现出先上升后下降趋势，5～8年总含量逐年增加，8年总含量为最高，9年以上生重楼皂苷总含量较7、8年生均减少，因此，建议大理滇重楼采收季节在7～8年。

表1 滇重楼的样品信息表

表2 重楼皂苷I、II、VI、VII、H 线性范围考察

图1 大理永平基地5～10年生滇重楼UPLC图谱

图2 重楼皂苷I、II、VI、VII、H混合对照品（A）及滇重楼根茎（B）色谱图

表3 大理永平基地5～10年滇重楼含量测定结果

表4 大理州不同地区8年生滇重楼含量测定结果

2.5.2 大理州不同产地滇重楼根茎主要皂苷类成分含量分析

大理州不同产地滇重楼根茎中重楼皂苷I、II、VI、VII、H含量，见表4，色谱图见图2。结果显示，大理州不同产地滇重楼根茎中均检测到药典规定的4种重楼皂苷I、II、VI、VII，其总含量的范围在0.765%～4.170%，均大于2015版《中国药典》一部规定的0.60%的质量控制标准，5种重楼皂苷总含量由大到小依次为S5(大理永平基地)＞S6(大理鹤庆)＞S1(大理大学教学实践基地，大理古城)＞S3(大理漕涧)＞S7(大理剑川)＞S4(大理巍山青华村)＞S2(大理宾川)＞S9(大理漾濞箐口村)＞S8(大理巍山三鹤村)，其中含量最高的为S5(大理永平基地)，最低的为S8(大理巍山三鹤村)，相差5倍多。大理州不同产地8年生滇重楼主要成分含量存在差异，但总体品质都达到药典标准。对于大理州种植区域以大理永平，大理鹤庆，大理大学教学实践基地(大理古城)为佳，五种重楼皂苷(I、II、VI、VII、H)总含量均大于1.5%。

3 讨论

笔者对大理永平基地不同年限6批(Y1～Y5，S5)滇重楼根茎中重楼皂苷I、II、VI、VII、H进行含量测定，6批样品均检测到5种重楼皂苷(I、II、VI、VII、H)。结果显示，大理不同生长年限滇重楼根茎中5种重楼皂苷的总含量总体呈现出先上升后下降趋势，5～8年5种重楼皂苷含量随年限增长而增加，9年及以上生滇重楼较7、8年生5种重楼皂苷含量均减少，含量最高的为8年生滇重楼。考虑时间、成本等因素，建议大理滇重楼采收年限为7～8年。这与赵庭周等[13]研究结果吻合，滇重楼中重楼皂苷含量随生长年份的增长而增加，第7年含量较高。也有相关文献对重楼其他种进行研究[9-10]，如南重楼，长柱重楼等，研究发现采收期也在7～8年。对不同产地9批(S1～S9)8年生滇重楼根茎中重楼皂苷I、II、VI、VII、H进行含量测定，9批样品均检测到5中重楼皂苷(I、II、VI、VII、H)。结果表明，大理州不同地区同年生滇重楼5种重楼皂苷含量存在差异，5种重楼皂苷总含量由大到小顺序依次为S5(大理永平基地)＞S6(大理鹤庆)＞S1(大理大学教学实践基地，大理古城)＞S3(大理漕涧)＞S7(大理剑川)＞S4(大理巍山青华村)＞S2(大理宾川)＞S9(大理漾濞箐口村)＞S8(大理巍山三鹤村)，含量最高的大理永平基地与含量最低的大理巍山三鹤村相差5倍多，其中永平、鹤庆、大理大学教学实践基地5种重楼皂苷总含量均大于1.5%，大于药典规定量的2.5倍，因此，大理滇重楼种植基地建议在大理永平、大理鹤庆、大理大学教学实践基地。

本实验通过超高效液相色谱法对大理州同地区不同生长年限及不同地区同生长年限滇重楼根茎中处理皂苷含量进行测定，为大理州滇重楼采收时间及种植区域规化提供了一定的参考依据，但尚未涉及大理州全部地区，今后还将收集检测更多大理州不同地区滇重楼的样品，为大理州种植区域规化得出进一步的结论。