王 斐,刘慧君,陈湘宁,王萍萍,汤 茜,刘 莹
(北京农学院 食品科学与工程学院/农产品有害微生物及农残安全检测与控制北京市重点实验室, 北京 102206)
洋葱,别称圆葱、玉葱,系百合科葱属的多年生草本植物,以肥大的肉质鳞茎供食用,营养价值较高[1]。洋葱富含多种含硫化合物、黄酮类化合物、钙、维生素等,是西餐中不可缺的配菜,故而有“蔬菜皇后”的美称[2]。
然而洋葱在鲜切加工过程中,破坏了表面天然保护屏障,导致营养汁液浸出,微生物繁殖速率加快。为了降低微生物含量,延长保鲜期,工厂在鲜切蔬菜加工过程中普遍采用次氯酸钠进行杀菌消毒。在鲜切菠菜、生菜、紫甘蓝、空心菜、薄荷、山药等均具有很好的消毒效果[3-8]。也有报道表明,次氯酸钠会影响蔬菜的营养品质,王顺民等研究发现次氯酸钠会降低菠菜的维生素[3]。HA 等研究发现次氯酸钠消毒对莴苣、芹菜以及白菜食品的外观和味道产生不良影响[6]。目前次氯酸钠对鲜切洋葱安全营养品质的研究尚未报道。
国内外科研工作者研究洋葱主要集中在生理活性物质方面。MONIKA 等研究洋葱皮的酚类物质,类黄酮以及抗氧化能力[9]。Jocelyn 等研究洋葱内槲皮素氧化代谢产物的抗氧化能力[9]。刘佳遥等研究了众多洋葱的特殊活性物质如类黄酮和酚类物质的提取[10],宁月宝等研究了风味物质以及异味物质的产生[11],Galsurke 等研究热消毒对洋葱鳞片中泡状转化酶活性的影响[13],Bedrníček 等将洋葱皮掺入向无麸质(GF)面包中可以提高其生物学价值[13],Ren 等对洋葱中的黄酮类化合物进行了全面的综述[14]。但对于次氯酸钠影响鲜切洋葱安全营养品质以及微生物多样性的研究尚未见报道。
本研究采用次氯酸钠处理鲜切洋葱,对贮存期间的感官指标、生理生化指标、营养指标、微生物指标、风味物质和微生物多样性进行了研究,揭示了次氯酸钠对鲜切洋葱安全营养品质以及微生物多样性的影响,可为鲜切洋葱的生产和加工以及有针对性研究新型消毒剂提供数据支撑。
黄皮普通洋葱 北京农学院自选超市;平板计数琼脂(Plate count agar,PCA)培养基,北京陆桥生物技术有限责任公司;维生素C 试剂盒、植物类黄酮试剂盒,南京建成生物研究所;次氯酸钠 天津光复精细化工研究所;磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、愈创木酚、过氧化氢溶液,北京化学试剂公司。
GC-MS 气相质谱联用仪 安捷伦公司;H1850R台式高速冷冻离心机,湘仪离心机仪器有限公司;ISO9001 天平,赛多利斯科学仪器有限公司;T6 新世纪分光光度计,北京谱析通用仪器有限责任公司;电热恒温水浴锅,上海一恒科技有限公司;BCD-288WSL 冰箱,青岛海尔股份有限公司;紫外分光光度计,宁波新芝生物科技有限公司;电热恒温培养箱,上海易恒实验仪器有限公司;PHS-3B 型酸度计,上海雷磁仪器厂;YXQ-LS-50SII 立式压力蒸汽灭菌锅,上海博讯实业有限公司医疗设备厂;一次性培养皿、聚酯包装袋 ,北京奥科科技有限公司。
选用大小均匀,无腐烂、无病虫害及机械损伤、个体完整的新鲜黄皮洋葱,经去除不可食用部分后,切分为1 cm×1 cm、 大小均匀的块。按照工厂加工消毒方法:先在 150 mg/L 次氯酸钠浸泡 5 min,再在50 mg/L 次氯酸钠中浸泡清洗30 s,用清水漂洗取出后在500 r/min 离心机中离心1 min 去除多余的水分。采用规格为190 mm × 250 mm 聚酯包装袋热封包装,每袋净重 (50±2) g。每个消毒重复3 次,同时以清水未消毒组做对照。消毒好的鲜切洋葱样品放置在 25 ℃室温内(普通洋葱在室温贮藏期间保质期较长,因此研究鲜切洋葱在室温下的品质,测定菌落总数及微生物多样性),0、1、2、3、4 d 分别取样测洋葱的感官指标、生理生化指标、营养指标和风味物质。
洋葱的感官指标主要包括色泽、风味、脆度、半透明化,感官评价标准见表1[15]。感官检验鉴定小组由10 人组成。
表1 鲜切洋葱的感官评价标准Table 1 Sensory evaluation criteria for fresh-cut onions
2.3.1 失重率 每天称量鲜切洋葱重量,求失重率:
W——失重率,%;
W0——第0 天鲜重,g;
Wn——第n 天鲜重,g。
2.3.2 酸度pH 将样品研磨,取10 g 放入离心管中,在4 ℃、10 000 r/min 离心10 min,取上清液用校准过的pH 计测样品pH 值[16]。
2.3.3 过氧化物酶(POD) 研磨成匀浆,在4 ℃、10 000 r/min 下离心15 min,取上清液,用分光光度计在470 nm 分别测0 min 和1 min 的吸光值[16]。
2.4.1 类黄酮 采用植物类黄酮检测试剂盒法测定。2.4.2 维生素C 采用维生素C 检测试剂盒法测定。
根据GB/T 4789.2—2016 测定[17]。
2.6.1 样品前消毒 参考成丽丽方法[18]测定风味物质。
准确称取剪碎后的5 g 样品于顶空小瓶中,用硅胶膜密封,放置在50 ℃恒温箱中预热15 min;插入老化的50/30 μm DVB/CAR/PDMS (二乙基苯/ 碳分子筛/聚二甲基硅氧烷)的萃取头[19-21]穿透样品隔垫;推手柄使纤维头伸出针管,置于样品上部空间,萃取时间为30 min;缩回纤维头,然后将针管退出顶空小瓶。将萃取头再插入GC-MS 手动进样口250 ℃解析5 min,供分析鉴定。
2.6.2 色谱-质谱工作条件 色谱条件:HP-5MS 毛细管柱(柱长30 m,内径0.25 μm,液膜厚度0.25 μm), 不分流,载气为氦气,流速:1 mL/min。柱温箱程序升温条件:35 ℃,保持2 min,以5 ℃/min 的升温至120 ℃,保持5 min,再以3 ℃/min 升至150 ℃,保持2 min;最后以10 ℃/min 升温到220 ℃,保持5 min。汽化室温度250 ℃。
质谱条件:电离方式为EI,电子能量为70 eV, 灯丝发射电流200 μA,离子源温度为230 ℃,扫描质量范围为34 ~348 M/Z。
图谱分析:将色谱峰与挥发性风味物质谱库比对分析,确定其种类。采用面积归一化法进行定量分析。
2.7.1 菌株总DNA 提取 分别取0、2、4 d 已消毒(样品编号Y1、Y2 和Y3)和未消毒(样品编号W1、W2 和W3)样品10 g 放置于无菌离心管中,液氮冷冻送至北京百迈客生物公司进行基因提取。每个样品做3 个平行。
2.7.2 PCR 扩增 以提取的总DNA 为模板采用16SrDNA 细菌 16S rRNA (V3+V4)区域引物:338F:5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3',806R:5'- GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'在引物末端加上测序接头进行PCR 扩增并对其产物进行纯化。PCR 扩增及测序工作由北京百迈客生物科技有限公司完成。
2.7.3 高通量测序数据分析 用Illumina HiSeq 2500 对V3 ~V4 区进行测序得到不同贮藏天数样品文库,使用QIIME(Version 1.8.0)软件中的 UCLUST[25]对Tags 在97%的相似度水平下进行聚类、获得OTU。利用QIIME 软件生成不同分类水平上的物种丰度表,并且计算Chao1 指数、Shannon指数和Simpson 指数对样品的微生物多样性进行评价,以评估当前的测序量是否代表了主要群落的多样性,以及样本的大小是否合理。
利用Origin9.1 软件、Excel 软件进行折线图分析,SPSS 19.0 数据系统进行数据统计。
随着贮藏时间延长,鲜切洋葱感官品质逐渐下降,主要表现在产生异味,色泽暗淡发黄,变软以及半透明率降低。由图1 可知,鲜切洋葱25 ℃葱贮藏期间,次氯酸钠消毒处理过的鲜切洋葱比未消毒洋葱感官品质下降慢。4 d 后未消毒组下降至不可食用状态(感官得分50 ~60),已消毒组保持良好品质(感官得分65 ~70)。
图1 不同贮存时间洋葱中感官评价得分图Fig.1 Sensory evaluation score chart at different storage times
鲜切洋葱0 ~4 d 内pH 值变化趋势如图2 所示。随着贮藏时间延长,未采用次氯酸钠消毒鲜切洋葱2 d 内pH 值快速下降,2 d 后下降缓慢,4 d 时pH值保持在4.75 左右。而消毒鲜切洋葱pH 值基本保持不变,0 ~4 d 始终维持在6.2 左右。
图2 不同贮存时间洋葱中pH 变化图Fig.2 Figure of pH change in onions at different storage times
失重率的测定可以判断果蔬的可食性。鲜切洋葱贮存过程中,随着时间延长,还出现了失水现象(图3)。3 d 后,未消毒鲜切洋葱失重率逐渐上升至4.2%左右,已消毒鲜切洋葱失重率上升至2.9%。结果表明次氯酸钠可以延缓鲜切洋葱失重率的降低。
过氧化物酶(POD)在植物组织中大量存在,活性较高,与植物呼吸作用以及组织发生褐变密切相关,加剧组织内新陈代谢和营养物质的分解。由图4 可知,消毒鲜切洋葱和未消毒洋葱中0 ~4 d内POD 酶活性均逐渐下降,其中已消毒鲜切洋葱POD 酶活性呈持续稳定下降,而未消毒鲜切洋葱POD 酶活性0 ~2 d 缓慢下降,2 d 后急剧下降,第4 天下降至与已消毒鲜切洋葱POD 酶活性水平接近。0 ~4 d 鲜切洋葱POD 酶活性均下降至 300 U/g FW·min,与单成海[23]等研究的洋葱在室温POD酶活性总体变化幅度较小不一致。
图3 不同贮存时间洋葱中失重率变化图Fig.3 Change graph of weight loss rate in onions at different storage times
图4 不同贮存时间洋葱中POD 变化图Fig.4 Changes of POD in onions at different storage times
Vc 是1 种重要的营养物质,在果蔬中含量较高,极易受外界条件影响发生降解, 因此其含量是衡量果蔬品质的重要指标[24]。随着贮藏时间延长,鲜切洋葱中Vc(图5)和类黄酮(图6)含量呈持续下降趋势。4 d 后,未消毒鲜切洋葱Vc 含量下降至 2.53 μg/mL, 已 消 毒 鲜 切 洋 葱Vc 含 量 下 降 至 5.58 μg/mL,差异较为显著(P<0.05),已消毒Vc 含量均显著降低,消毒组Vc 高于未消毒组,表明次氯酸钠消毒可以延缓Vc 的下降,这与王顺民等人研究的次氯酸钠加剧减少菠菜Vc 含量结果不一致[4];4 d 后未消毒和已消毒类黄酮含量无显著差异(P>0.05)。
图5 不同贮存时间洋葱中Vc 含量Fig.5 Vc content change at different storage times
0 ~4 d 内,次氯酸钠未消毒和消毒鲜切洋葱样品中菌落总数均持续升高(图7),由于洋葱本身具有抑菌物质,0 ~2 d 内消毒组与未消毒组无显著差异,4 d 后菌落总数分别为6.1×107cfu/mL 与5.81×107cfu/mL,二者无显著差异。次氯酸钠对鲜切洋葱表面致病菌有消毒效果[15],对菌落总数未表现出明显的抑菌效果,不同于次氯酸钠对菠菜、生菜等蔬菜上微生物的抑菌效果[3-9],可能与洋葱表面的菌群种类有关,可对洋葱上的微生物多样性做进一步研究分析。
图7 不同贮存时间洋葱中菌落总数变化图Fig.7 Variation of microorganisms in onions at different storage times
分别对消毒和未消毒鲜切洋葱0、1、2、3 和4 d样品进行SPME-GC-MS 分析,共检测到了匹配度为70%以上的风味物质21 种,包括5 种烷烃、6 种酯类、5 种硫代化合物、2 种醇类和1 种烯烃类等。由表2可知,0 d 时,未消毒鲜切洋葱中酯类有9,12-十六碳烯酸甲酯、油酸乙酯、肉桂酸乙酯和十六酸乙酯等,醇类有二甲基正戊醇和苯乙醇,硫代化合物有二丙基二硫、甲基丙基二硫化合物和二甲基四硫化合物;消毒鲜切洋葱中烷烃有正十七烷和1,1-二甲基锗杂环丁烷,酯类有9,12-十六碳烯酸甲酯、油酸乙酯和十六酸乙酯,醇类有苯乙醇,硫代化合物有二甲基二硫。比较发现,鲜切洋葱经次氯酸钠消毒后,生成了正十七烷和1,1-二甲基锗杂环丁烷,缺少了二甲基正戊醇、甲基丙基二硫化合物和二甲基四硫化合物。甲基丙基二硫化合物和二甲基四硫化合物是洋葱特有的风味物质[25],结果表明,次氯酸钠消毒损失了洋葱特有的风味物质。比较贮存期间风味物质发现,3 ~4 d 后,未消毒和消毒组洋葱中均含有的物质有十六酸乙酯、硫代丙酰胺、二甲基三硫醚、双酚A 和棕榈酸,和0 d 比较发现,鲜切洋葱中损失了醇类和大部分酯类芳香物质,以及洋葱特有的风味物质二丙基二硫,其中未消毒洋葱还损失了甲基丙基二硫化合物和二甲基四硫化合物,生成了硫代丙酰胺、二甲基三硫醚、双酚A 和棕榈酸,表明随着洋葱贮存时间变长,产生了具有硫臭异味的二甲基三硫醚,以及其他气体物质硫代丙酰胺、双酚A 和棕榈酸。
表2 不同贮存时间鲜切洋葱风味物质含量Table 2 Flavor content of fresh-cut onions before and after disinfection at different storage times
3.6.1 Alpha 多样性分析 基于97%相似度水平的OTU 数,各样品Alpha 多样性指数值统计如表3 所示,由菌群丰度(Chao1 和ACE)和菌群多样性指数(Shannon 和Simpson)可知,6 个样品中的Simpson 指数在0.16 ~0.54 之间,Shannon 指数在1.11 ~2.06 之间,并且和Shannon 指数呈反比,且W1、Y5 的Simpson 指数与Shannon 指数数值相差较多,W1 的多样性指数最高,Y5 多样性指数最低。随着贮存时间延长,洋葱中细菌的物种多样性降低,次氯酸钠消毒可以降低洋葱中细菌物种多样性。
表3 Alpha 多样性指数统计Table 3 Alpha diversity index statistics
3.6.2 细菌群落的OTUs 聚类分析 由表4 可知,W1、W3、W5、Y1、Y3 和Y5 样本所获得的细菌原始序列数(总tags 数)平均值分别为77 901、78 401、78 629、68 026、73 018、77 786 条,序列平均长度425 bp。如图8 所示,所有样品的稀释曲线都已进入平台期,说明测序数据量合理,测序深度已基本覆盖样品中所有微生物,更多的数据量对发现新的OTUs 边际贡献很小。0、2、4 d 未消毒和消毒组样品细菌原始序列数逐渐增加,表明随着鲜切洋葱贮存时间延长,细菌总数增加,且消毒后细菌总数减少。差异显著性分析表明,W1 与Y1、W3与Y3 和W5 与Y5 均无显著性差异,表明次氯酸钠对洋葱中的细菌无杀灭作用。
表4 不同贮存时间洋葱中样品测序数据结果统计Table 4 Statistics of processing results of sample sequencing data in onions at different storage times
图8 样品的细菌稀疏曲线图Fig.8 Bacterial sparse curve of the sample
3.6.3 细菌菌落物种结构分析 用QIIME 软件挑选出属分类学水平上丰度最高的OTU 的序列作为代表序列,进行多重序列比对并构建系统进化树,然后通过Python 语言工具绘制图形,如图9 所示。进化树中每条树枝代表1 个物种,树枝长度为2 个物种间的进化距离,即物种的差异程度,其中相同颜色属名代表所属于相同的门,消毒组与未消毒组鲜切洋葱在门水平上有5 个,分别是蓝藻菌门(Cyanobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、变形菌门(Proteobacteria)和放线菌门(Actinobacteria),其中变形菌门是系统发生树中最大的分支,但相关性较少。变形菌门菌属大部分来自于土壤中种植的新鲜蔬菜,厚壁菌门分支较大且相关性较高,厚壁菌门中有多种益生菌种属,如乳杆菌属、明串球菌属及肠球菌属等[26],与属水平相对含量图分析相似。
图9 鲜切洋葱细菌菌落系统进化树Fig.9 Phylogenetic tree of fresh-cut onion bacterial colonies
3.6.4 细菌群落的丰度分析 在菌属水平上基于 Beta 变化对每个样品的菌群结构及分布进行分析,由图10可知,6 组样品中主要菌属有明串菌属(Leuconostoc)、葱属(Allium_ampelopra sum_leek)、拉乌尔泰拉属(Raoult ella)、肠杆菌属(Kosakonia)、肠细菌属(Enterobacterium)、泛菌属(Pantoea)、果胶细菌(Pectobacterium)、Orontium_aquaticum、 魏 斯 氏属(Weissella)及其他菌属,菌属组成相似。其中,未消毒鲜切洋葱优势菌属依次为魏斯氏属(相对丰度10.00%~33.06%)变形菌门中的肠细菌属(相对丰度27.22%~28.42%)和放线菌门中的明串菌属(相对丰度17.26%~18.54%);消毒鲜切洋葱中优势菌分别为厚壁菌门(Firmicutes)中的魏斯氏属(相对丰度51.82%~71.84%)、蓝藻菌门中的Allium_ampeloprasum_leek(相对丰度15.89%~17.73%)和放线菌门中的明串菌属(相对丰度6.42%~9.25%)。结果表明,次氯酸钠对洋葱中的肠细菌属和明串菌属细菌有明显抑制作用,对Allium_ampeloprasum_leek 无明显抑制作用,而对魏斯氏属细菌可能具有促进作用。3.6.5 鲜切洋葱UPGMA 分析 UPGMA(Unweighted Pair-group Method with Arithmetic Mean)为样品层次聚类,是1 种常用的聚类分析方法。对未消毒和消毒鲜切洋葱在不同的贮藏时间下6 个样品在细菌相似性进行聚类分析。通过对分支长短及相似程度进行分析[27]。W1、W3、W5 样品微生物多样性基本接近,细菌菌属为一类。Y1、Y3、Y5 样品微生物多样性基本接近,细菌菌属为一类。表明相同加工制作样品之间微生物差异性很小,即次氯酸消毒和未消毒是影响洋葱表面细菌微生物多样性的主要因素(图11)。
图10 不同鲜切洋葱样品属水平细菌丰度分析Fig.10 Analysis of bacterial abundance levels in different fresh-cut onion samples
图11 不同鲜切洋葱样品UPGMA 分析Fig.11 UPGMA analysis of different fresh cut onion samples
感官品质是商品价值最直接的反应,鲜切洋葱的感官指标包括外观,风味,脆度等[28],黄皮洋葱经切分后用一定浓度的次氯酸钠消毒剂清洗,可以保持其良好感官品质。与燕平梅等[29]证明次氯酸钠可以保持豇豆的品质结果一致。鲜切洋葱属于弱酸性食品,贮藏条件与加工方式会影响pH 值,温度和机械损伤会使鲜切洋葱中有机酸积累,从而使 pH 值降低[30-31]。未经处理的鲜切洋葱pH 下降,而次氯酸钠的使用防止了切割导致pH 下降。蔬菜在鲜切过程会导致果蔬呼吸作用加剧导,造成营养物质消耗及水分流失,同时也存在一定的蒸腾作用,使得鲜切果蔬整体重量损失[2]。未处理组失重率降低,次氯酸钠可以延缓鲜切洋葱失重率降低。POD酶参与植物的生长、木质素合成及褐变等多项代谢活动,与植物抗逆防御体系密切相关[32]。试验表明次氯酸钠可以破坏POD 酶活性。维C 与类黄酮都是洋葱特有的营养物质,鲜切蔬菜在贮藏过程中营养物质流失较多[33]。鲜切菜在货架期内, 类黄酮和维生素 C 等抗氧化物质含量降低[34]。试验表明,未消毒组鲜切洋葱维C 含量降低,次氯酸钠处理后延缓鲜切洋葱维C 含量降低。与陈学玲等研究次氯酸钠可以延缓鲜切西兰花维C 含量与失重率降低结果一致,与其研究延缓POD 酶活性下降矛盾[35]。Moreno-Ortega 等人研究热处理导致鲜切洋葱类黄酮含量下降[36]。赵蕾等人研究NO 可以抑制鲜切胡萝卜类黄酮等次生代谢产物[37]。而次氯酸钠对鲜切洋葱类黄酮含量无明显影响。
切割洋葱使人产生流泪的不适感,经次氯酸钠消毒后损失了洋葱特有的风味物质(酯类和醇类物质),并随时间的延长产生了具有硫臭异味的二甲基三硫醚,以及其他气体物质硫代丙酰胺、双酚A 和棕榈酸。在消毒前鲜切洋葱中检测到了二丙基三硫醚、二甲基四硫化物等含硫化合物,这与Coca[38]等研究结果一致。未消毒消毒鲜切洋葱随贮藏时间延长,检测出硫代丙酰胺,二羟基环十五烷酮,二甲基三硫醚,是成丽丽等[19]研究结果中没有检测出的物质,其中检测出硫代丙酰胺、二甲基三硫醚最高,这与于洋等研究猜测异味源于硫代化合物吻合[39]。目前对于洋葱风味物质分析研究较少,并且次氯酸钠与洋葱风味物质的反应机制原理尚不明确。
微生物的生长对蔬菜的安全性也有一定的影响。目前,鲜切蔬菜上常见的病原微生物可分为致病菌和致腐菌。常见致病菌包括单核细胞增多性李斯特菌 (Listeria monocytogenes)、沙门氏菌(Salmonella)、大肠杆菌O157:H7(E. coli O157:H7)、志贺氏杆菌属 (Shigella spp.) 和金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)等[40-42]。国内企业在鲜切菜生产过程中普遍使用次氯酸钠溶液作为消毒剂,降低蔬菜表面微生物。《GB/T 36758—2018 含氯消毒剂卫生要求》中,次氯酸钠是1 种含氯消毒剂,用途包括“果蔬”消毒。相关研究表明次氯酸钠对生鲜蔬菜,鲜切西蓝花表面细菌菌落,腐败菌,沙门氏菌以及水中菌落总数、大肠菌群有一定的消毒效果[43-44]。本试验结果表明次氯酸钠消毒剂对鲜切洋葱的菌落总数无消毒作用,通过高通量测序后发现鲜切洋葱表面存在魏斯氏属、肠细菌属、明串菌属。次氯酸钠消毒后对肠细菌属和明串菌属细菌有明显抑制作用,对魏斯氏属细菌可能具有促进作用。可能是次氯酸钠不稳定,见光易分解,果蔬消毒后能较快分解,对于次氯酸钠在鲜切菜消毒过程中可能产生的物质以及余氯对鲜切菜使用安全性的影响,有待进一步研究。
次氯酸钠消毒剂可以保持鲜切洋葱良好感官品质,延缓失重率、维生素含量的降低,破坏POD 酶的活性,对类黄酮含量无影响,使得鲜切洋葱pH变为6.2 左右。同时鲜切洋葱品质的下降与风味物质有关,次氯酸钠消毒鲜切洋葱后醇类、酯类物质与部分硫代化合物减少,产生具有硫臭异味的二甲基三硫醚。洋葱中细菌的物种多样性随着贮存时间延长降低,次氯酸钠消毒可以降低洋葱中细菌物种多样性。次氯酸钠对洋葱中的细菌总数无明显抑制作用,抑制肠细菌属和明串菌属细菌的生长,对魏斯氏属细菌无抑制作用。因此,有待研究新型消毒剂抑制鲜切洋葱优势菌生长。