荭草素通过激活PGC－1β 发挥抗糖尿病心肌病作用

王 倩，林文娟，王 娜，张 冰

糖尿病增加了患心脏病的风险，50%的糖尿病患者死于心血管疾病［1］。炎症和氧化应激激活是糖尿病心肌损伤显著的病理生理过程，也会导致心肌细胞内蛋白质量调控障碍，目前仍亟待探索有效的药物和分子靶点来控制糖尿病心肌病的发展［1－2］。糖尿病患者的心力衰竭发病率非常高，而且糖尿病患者的预后比非糖尿病患者更差。实验数据表明，多种机制导致糖尿病患者收缩期和舒张期功能受损，这些患者的心脏衰竭与冠状动脉疾病或相关危险因素无关［3］。

荭草素（Orientin）是从天然植物中分离出来的黄酮类成分，在近几年的研究中，荭草素已被探究证实具有丰富的细胞组织保护特性，如抗氧化应激、抗炎、抗癌和抗血栓活性［4－5］。荭草素能够通过调节Toll 样受体－4／核转录因子－κB／肿瘤坏死因子－α信号通路发挥抗炎作用，从而对大鼠脑缺血／再灌注损伤发挥保护作用［6］。近期研究证实，荭草素能够通过调节内皮型一氧化氮合酶／一氧化氮（eNOS／NO）信号通路发挥抗氧化应激作用，从而能够减轻小鼠心梗后心肌病理性重构［7］。迄今为止，荭草素是否能对糖尿病心肌病发挥保护作用尚无研究报道。本研究将探究荭草素在糖尿病心肌病中发挥的作用及潜在的分子机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 雄性C57BL／6 小鼠（20～25 g，8～10 周龄）从实验动物中心获得，在22～24℃的12 h的光／暗周期下被笼养，吃定期的颗粒饲料。

1.2 实验试剂 纯度＞98%的荭草素（融禾，上海），检测超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性和丙二醛（malonaldehyde，MDA）含量试剂盒（南京建城）。抗PGC－1β 的抗体（Abcam，美国），抗GAPDH 的抗体（cmcTAG 公司，美国），Trizol 试剂和RNA 提取试剂盒（天根，北京），引物合成（GenScript，南京），评价H9C2 细胞内活性氧（reac⁃tive oxygen，ROS）生成的荧光探针2′，7′－二氯荧光素二乙酸酯（DCFH－DA）（碧云天，上海）。

1.3 小鼠分组及处理方式 将雄性C57 小鼠随机分为3 组：同笼阴性小鼠分为对照组（CON 组，n ＝12）、糖尿病组（DCM 组，n ＝12）和按常规腹腔注射链脲佐菌素（Streptozotocin，STZ）50 mg／kg）诱导小鼠糖尿病模型的外源补充荭草素小鼠糖尿病组（DCM＋ORI 组，n ＝12）。DCM＋ORI 组小鼠每天通过灌胃外源补充荭草素（溶于生理盐水，剂量为40 mg／kg），DCM 组仅补充相同量的生理盐水。喂养8周后进行后续实验。

1.3.1 小鼠心脏超声检测 超声工作者完全未知研究方案和动物组。使用VisualStulic 770 超声仪器进行小鼠心脏超声检查，30 MHz 的传感器记录左胸骨旁胸腺的长轴和短轴。超声心动图检测的指标包括左室射血分数（left ventricular ejection fraction，LVEF）和左室缩短分数（left ventricular fractional shortening，LVFS）、舒张末期室间隔（intraventricular septal thickness end diastasis，IVSd）和舒张末期左室后壁（left ventricular positerior wall end diastasis，LVPWd）厚度。以上参数由Vevo Lab 3.1.0 软件计算得出。

1.3.2 小鼠心肌组织学染色 用苏木精－伊红（HE）或Masson 三色染色法分别对心肌组织的其他部分进行染色，以评估心肌细胞的横截面积和胶原沉积。切片用数字扫描成像系统（Olympus FV1000，日本）进行可视化，心肌细胞横截面积和纤维化程度用Image J 软件（NIH，Bethesda，MD，USA）进行量化。

1.3.3 小鼠心肌组织MDA 和SOD 的测定 检测心脏组织中氧化应激标记物MDA 含量和SOD 活性，步骤基于制造商的说明。通过SpectraMax M5 装置使用分光光度法分析数据。

1.3.4 实时荧光定量聚合酶链反应（RT－qPCR）检测mRNA 表达 采集左心室壁部分组织，按照RNA提取试剂盒的指示从标本（或处理后培养的H9C2细胞）中提取总RNA。然后利用上标第一链合成系统（Invitrogen，CA，USA）将RNA 反向转化为互补DNA。用CFX96 实时聚合酶链反应系统C1000 热循环仪（美国）进行RT－qPCR。磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）是靶基因转录水平正常化的标准基因。本研究中使用的引物序列列于表1 中。

1.3.5 H9C2 心肌细胞的培养 将H9C2 细胞按（1～2）×105个／ml 均匀种于六孔板中，于含10%胎牛血清的低糖培养基中置于细胞培养箱（5% CO2、饱和湿度、37 ℃）无菌培养。细胞分为3：组对照组、高糖组和高糖＋荭草素组。高糖＋荭草素组同时加入荭草素生理盐水溶液，使培养液中荭草素浓度为10 μmol，分别给予低糖和高糖培养基培养48 h，进行后续实验。然后用DCFH－DA 进行共聚焦染色，DCFH－DA 在ROS 的作用下在细胞内脱酯化，转化为高荧光分子2′，7′－二氯荧光素。通过激发波长488 nm 和发射波长525 nm 28 的荧光强度测定细胞ROS 的产生。

1.3.6 Western－blot 检测PGC－1β 的表达 用RI⁃PA 裂解缓冲液提取左心室组织和H9C2 的总蛋白。测定蛋白浓度后用10%十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳分离每个样品的蛋白质，再转移到聚偏二氟乙烯膜（Millipore，USA）。将5%脱脂奶粉溶解在洗膜缓冲液中（150 mmol NaCl、50 mmol Tris（pH 7.5）和0.1%吐温－20℃封闭膜2～3 h（20～25℃）。根据分子量分离膜，在4℃下与相应的一级抗体孵育12 h，再用相应的辣根过氧化物酶结合的第二抗体在20～25℃孵育2 h，加入电化学发光试剂，并使用CeimDoc XR（Bio Rad，美国）扫描印迹。对蛋白质条带的灰度值进行可视化分析，以GAPDH 为内参对照。

1.4 统计学分析 应用GraphPad Prism 7.0 进行处理和分析，所有数据均以均数±标准差（±s）表示，多组间差异的统计学意义用单向ANOV A 处理，P＜0.05 有统计学意义。

2 结果

2.1 外源补充荭草素显著改善糖尿病导致的心功能损伤 8 周后小鼠心脏超声检测发现，DCM 组小鼠心功能较CON 组显著损伤，表现为LVEF 和LVFS 显著降低，而DCM＋ORI 组能够显著改善小鼠心功能（图1 A～C）。又检测了反映心脏重构的心肌肥厚指数之一心体比（heart weight／body weight，HW／BW），结果显示，DCM 组小鼠心体比较CON 组显著升高，而DCM＋ORI 组小鼠心体比较DCM 组显著下调（图1 D）。

2.2 外源补充荭草素显著减轻糖尿病导致的心肌肥厚和纤维化 HE 染色结果显示，DCM 组小鼠心肌细胞较CON 组显著肥大，而DCM＋ORI 组能够显著减轻DCM 组小鼠心肌细胞病理性肥大（图2 A 和B）。MASSON 染色结果显示，糖尿病心肌病小鼠左室壁心肌组织纤维化较CON 组显著加重，而DCM＋ORI 组小鼠心肌纤维化显著减轻（图2 C 和D）。

2.3 外源补充荭草素显著减轻糖尿病小鼠心肌组织氧化应激损伤 DCM 组小鼠心肌组织MDA 含量较CON 组显著升高，SOD 含量显著降低，而DCM＋ORI 组可以显著减弱这种效应（图3 a 和b）。进一步通过RT－qPCR 检测氧化应激标志物NOX2 和NOX4 的mRNA 表达，结果显示DCM 组小鼠心肌组织NOX2 和NOX4 表达量较CON 组显著升高，而DCM＋ORI 组能够显著降低NOX2 和NOX4 的表达（图3 C 和D）。

2.4 荭草素显著减轻高糖培养的H9C2 细胞氧化应激损伤 高糖组H9C2 细胞ROS 生成量较对照组显著升高，而DCM＋ORI 组能够显著减少高糖诱导的心肌细胞内ROS 生成，从而减轻氧化应激损伤（图4）。

2.5 荭草素显著增强糖尿病小鼠心肌组织和高糖培养H9C2 细胞PGC－1β 的表达 糖尿病小鼠心肌组织PGC－1β 的表达量较CON 组显著降低，而DCM＋ORI 组显著激活糖尿病小鼠心肌组织内PGC－1β 的表达（图5 A）。高糖培养下H9C2 心肌细胞内PGC－1β 表达量较对照组显著降低，而高糖＋荭草素组心肌细胞内PGC－1β 表达量显著升高（图5 B）。结果提示荭草素能够显著增强糖尿病小鼠心肌组织和高糖培养H9C2 细胞PGC－1β 的表达。

3 讨论

近年来，由于多种中草药被证实具有抗炎、抗凋亡、抗氧化应激的保护作用，成为心血管疾病领域的研究热点［8］。荭草素就是其中之一，本研究首次证实荭草素治疗能有效地抑制高糖诱导的心肌细胞氧化应激，无论是在体内还是在体外，最终都能阻止糖尿病心肌病小鼠心肌纤维化和心肌肥厚，改善心肌功能。在机制上，荭草素能够通过激活心肌组织中的PGC－1β 发挥抗氧化应激作用，从而保护糖尿病心肌病小鼠心肌组织。

图1 三组小鼠心脏超声检测LVEF、LVFS 和HW／BW 比较（n＝6）

图2 三组小鼠HE、MASSON 染色及横截断面积、左室胶原蛋白量比较（n＝6）

图3 三组小鼠MDA、SOD、NOX4 和NOX2 表达的比较（n＝6）

图4 H9C2 细胞培养ROS 荧光强度比较（n＝5）

糖尿病心肌病引起的心脏重塑的重要标志是心肌肥厚和心肌纤维化，心肌肥厚也通过增加的心脏质量反映。心肌纤维化和心肌细胞肥大是解释糖尿病心肌病心脏改变的最常见机制。一些研究表明，糖尿病导致细胞钙转运缺陷、心肌收缩蛋白缺陷和胶原形成增加，导致心肌解剖和生理变化［9］。本研究结果显示荭草素外源补充能够显著减轻糖尿病心肌病小鼠心肌组织肥厚和纤维化程度，提示荭草素能够显著改善糖尿病心肌损伤。在动物在体实验中也有类似的发现，与对照动物相比，糖尿病动物的心率、收缩压和收缩分数显著降低［10］。临床研究也提示，糖尿病与左室心肌收缩和舒张功能的附加损害独立相关［11］。这些研究表明糖尿病是收缩功能障碍的原因之一，而本研究证实外源补充荭草素能够显著改善高糖导致的小鼠心功能障碍，也显示了荭草素的心肌保护作用。

图5 三组小鼠心肌组织和高糖培养H9C2 细胞PGC－1β 的表达

糖尿病心肌病的代谢异常刺激ROS 生成，如高血糖、高脂血症和晚期糖基化终产物的积累，最终导致细胞内氧化应激［12］。持续升高的氧化应激状态有过度消耗内源性抗氧化剂的趋势，如SOD，并伴随着氧化应激产物如MDA 在心脏中的积累［13－14］。检测SOD、MDA 及ROS 的含量成为检验细胞或组织中氧化应激程度的重要检测指标［15］。为了抵抗持续氧化应激的损害，已经形成了一系列内源性抗氧化机制，其中之一是过氧化体增殖活化受体γ 辅助活化受体因子（PGC－1β）［16］。PGC－ 1β 主要在心脏等氧化组织中表达，并调节线粒体的生物合成和代谢以及包含电子传递链的蛋白质［17］。以往的研究表明，PGC－1β 在压力超负荷诱导的心肌肥大过程中具有良好的保护作用，通过维持葡萄糖代谢和减轻氧化应激来抗心肌肥厚［18］。压力超负荷下，心肌组织PGC－1β 的表达显著降低，可导致心肌组织或心肌细胞ROS 生成、MDA 含量和NOX4 表达增加，SOD 活性降低，而通过激活PGC－1β 可以显著逆转这一效应［17］。本研究结果显示，糖尿病心肌病小鼠心肌组织和高糖处理的H9C2 细胞PGC－1β 的表达较对照组显著下调，而外源补充荭草素能够显著激活PGC－1β 的表达，提示荭草素能够通过激活心肌细胞内PGC－1β 的表达发挥抗氧化应激作用，从而减轻高糖对心肌细胞的损伤。所有这些证据表明，靶向PGC－1β 可能是治疗糖尿病心肌病的一种有前途的策略。荭草素前期被证实有多种药理活性，如抗氧化应激、抗炎、抗癌和抗血栓活性［4－5］。荭草素能够通过调节TLR4／NF－κB／TNF－α 信号通路发挥抗炎作用，从而对大鼠脑缺血／再灌注损伤发挥保护作用［6］。近期研究证实，荭草素能够通过调节eNOS／NO 信号通路发挥抗氧化应激作用，从而能够减轻小鼠心梗后心肌病理性重构［7］。

综上所述，本研究从在体和离体两方面展示了荭草素对糖尿病心肌损伤的保护作用，在机制上荭草素能够通过激活PGC－1β 的表达，进一步减轻高糖诱导的心肌细胞氧化应激损伤，为糖尿病心肌病治疗提供重要药物治疗靶点。后续实验将进一步完善和深入，以增强论证强度，为荭草素进一步在临床中糖尿病患者的应用提供理论依据。