高效液相色谱法测定浸铀酸液中7种有机酸

李文娟，刘莎莎，徐玲玲，龚 甜

(东华理工大学水资源与环境工程学院，江西 南昌 330013)

微生物溶浸是近年来新兴起的一门技术。微生物浸铀具有工艺简单、原料消耗少、成本低、能够将难浸及低品位矿床浸出率提高的特点，微生物溶浸可强化浸出过程并改善铀浸出动力学，特别是对于低品位难浸铀矿在提高铀浸出率、降低生产成本等方面具有独特优势[1-2]。异养型浸矿微生物的浸矿机制主要是通过产生有机酸等代谢产物，与矿石发生酸解、氧化还原或络合作用，最终实现铀的浸出，部分细菌还可以吸附在铀矿表面与铀矿发生直接作用[3]。本研究是以土豆淀粉等为原料，产生代谢物各种小分子有机酸与铀矿作用，从而达到溶浸出铀的目的。实验过程中产生的有机酸采用高效液相色谱法测定。

1 实 验

1.1 仪器和试剂

Agilent1260高效液相色谱仪；Agilent色谱工作站；Milli-Q7000超纯水器(出水电阻大于18 MΩ)，德国默克；SB-5200D超声波清洗器，宁波新芝生物科技股份公司。

乙腈(色谱纯)；甲醇(色谱纯)。除L-乳酸的纯度为86%外，其余标准品纯度均>99%，20 mmol NaH2PO4-H3PO4缓冲液(pH=2.0，真空抽滤)。实验中所用标准品，草酸(1 L 0.1 N标准溶液)，ACROS(品牌)，北京伊诺凯科技有限公司；L-苹果酸(100 mg)，中检所，北京伊诺凯科技有限公司；L-乳酸(100 mL)，VETEC；α-酮戊二酸(20 mg)，北京盛世康普化工技术研究院；柠檬酸(250 mg)，Aladdin，北京伊诺凯科技有限公司；琥珀酸(1 g)，Aladdin，北京伊诺凯科技有限公司；富马酸(20 mg)，北京盛世康普化工技术研究院。

1.2 微生物样品的采集和制备

在土豆蔗糖培养基中，接种约含有6.5×105 spores的孢子悬浮液，然后在25 ℃，频率为200 r/min的条件下，震荡培养黑曲霉60 h后取其代谢液1 mL，过滤去除菌丝，并用流动相稀释100倍，最后过0.22 μm滤膜。

1.3 色谱条件

色谱柱：美国Zorbax SB-Aq(4.6 mm×250 mm，5 μm)；

保护柱：美国USHXB13566(4.6 mm×50 mm，5 μm)；

流动相：20 mmol NaH2PO4-H3PO4缓冲液，pH=2.0；

流速：1.0 mL/min；

柱温：30 ℃；

进样体积：20 μL；

理论塔板数：按40 μg/mL奈计为16000。结果见图1；

紫外检测波长：210 nm。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的选择

2.1.1 色谱柱的选择

有机酸是一类重要的有机化合物，在大多数反相液相色谱(RPLC)条件下，有机酸很难保留，而离子抑制色谱法的应用(ISC)是一个提高保留率和选择性的方便而直接的方法。在ISC下，淋洗液的pH值必须在2左右低于分析物酸的pKa值，在这种条件下，酸是分子形式的，可保留和分离。本研究所采用的RPLC ZORBAX SB Aq柱采用大体积侧链的使用显著改善了柱/键合相，所以此柱在酸性洗脱条件下能应用在完全含水的溶液中。用40 μg/mL的奈测定色谱柱的柱效见图1，萘的保留时间为5.564 min，与此柱出厂时安捷伦公司测定的5.600 min相差0.036 min，且分离度良好，可见RPLC ZORBAX SB-Aq柱柱效良好。

图1 40 μg/mL奈的HPLC色谱图

2.1.2 流动相及其浓度的选择

选择流动相是高效液相色谱分析的重要步骤，常用的流动相有甲醇溶液，乙腈溶液和磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液是反相色谱柱上应用较广的流动相。根据测定对象是微生物代谢产物有机酸，经过比较大量的有机酸测定谱图，本研究着重选择了80%的甲醇-水溶液，80%的乙腈-水溶液，99%的磷酸盐缓冲液-1%的乙腈溶液，及100%的磷酸盐缓冲液作流动相比较分离情况，见图2～图5。

图2 80%的甲醇水溶液为流动相测定七种有机酸的标准HPLC色谱图

图3 80%的乙腈水溶液为流动相测定七种有机酸的标准HPLC色谱图

图4 99%的磷酸盐缓冲液和1%的乙腈溶液为流动相测定七种有机酸标准的HPLC色谱图

图5 100%的磷酸盐缓冲液为流动相测定七种有机酸的标准HPLC色谱图

结果表明，以磷酸盐缓冲液为流动相时，能较好地分离7种有机酸，所以选择磷酸盐缓冲液为流动相。磷酸二氢钠溶液的浓度直接影响流动相的稳定性，从而影响色谱柱分离效果。通过比较发现，20，35和40 mmol/L的3种不同浓度磷酸盐缓冲液为流动相时，对7种有机酸都能得到很好的分离效果。由于高浓度的盐溶液，增加流动相的本底吸收、降低灵敏度，影响分离效果，并缩短色谱柱寿命。因此选择浓度20 mmol/L NaH2PO4-H3PO4缓冲液(pH=2)为流动相。

2.1.3 流动相流速的选择

用浓度为20 mmol/L的磷酸二氢钠缓冲液做为流动相测定七种有机酸混标，其流速为0.8、1.0、1.5、2.0 mL/min时，得到的分离情况见图6～图9。

图6 流速为0.8 mL/min时测定有机酸的标准HPLC色谱图Fig.6 The HPLC chromatogram of standard mixture of seven organic acids with 0.8 mL/min图7 流速为1.0 mL/min时测定有机酸的标准HPLC色谱图Fig.7 The HPLC chromatogram of standard mixture of seven organic acids with 1.0 mL/min图8 流速为1.5 mL/min时测定有机酸的标准HPLC色谱图Fig.8 The HPLC chromatogram of standard mixture of seven organic acids with 1.5 mL/min图9 流速为2.0 mL/min时测定有机酸的标准HPLC色谱图Fig.9 The HPLC chromatogram of standard mixture of seven organic acids with 2.0 mL/min

实验结果表明：在不同流速下，7种有机酸都能得到很好的分离，当流速过小时分离时间会延长，流速过大又会引起柱压的升高，因此本研究在有机酸样品能得到较好分离的前提下，选择1.0 mL/min作为流动相的流速。

2.2 精密度实验

在选定色谱条件下，测定7种有机酸的保留时间和峰面积的精密度见表1。七种组分保留时间的RSD分别为0.28%、0.12%、0.14%、0.05%、0.19%、0.03%、0.14%，均小于0.3%，表明精密度良好。

表1 7种有机酸保留时间的相对标准偏差

表2 7种有机酸峰面积的相对标准偏差

标准样品在一个浓度进样5次的条件下，7种有机酸组分峰面积的RSD分别为0.42%、1.60%、1.79%、0.84%、0.24%、2.09%、0.12%，小于2.1%，表明精密度良好。

2.3 标准曲线及线性度

标准溶液的配制：分别准确称取标准品L-苹果酸0.1341 g、α-酮戊二酸0.1461 g、柠檬酸0.1921 g、琥珀酸0.1181 g、富马酸0.1161 g，溶解并用流动相(99%的20 mmol/L磷酸缓冲液(pH=2)+1%的乙腈)定容至10 mL的容量瓶中，配成0.1 mol/L的标准储备液；草酸直接使用购买的0.05 mol/L的标准储备液；称量10 g的乳酸标准贮备液稀释至10 mL的容量瓶中配成860 mg/L的标准储备液。将标准贮备液置于4 ℃冰箱中保存，使用时用流动相稀释成所需浓度[4]，具体浓度见表3。

表3 7种有机酸标准浓度系列

打开高效液相色谱仪，平衡50 min后，按照选定的色谱条件将表3中的5个混合标准液依次进样分析，得到其相关系数和回归方程，见表4，结果表明：7种组分在其质量浓度范围内线性关系良好。标样谱图见图10。

表4 7种有机酸的保留时间、相关系数、回归方程

图10 7种有机酸标准液谱图

2.4 样品的测定

2.4.1 加标回收

根据微生物浸铀的各个阶段浸出液样中含有不同成分来模拟实际样品并稀释100倍，在稀释后的样品中准确加入一定量的7种有机酸标液，混匀，经过0.22 μm滤膜真空过滤[5]，在相同的色谱条件下进样，直接进样测定5次，根据线性方程得到样品的有机酸含量，计算加标回收率[6]，其加标回收率为96.0%～109.3%(见表5)。

表5 加标回收率

2.4.2 实际样品的测定

准确移取pH值为1.66、1.81、2.11的土豆培养基代谢液，用于浸取铀矿的黑曲霉代谢产生的有机酸液1 mL，并稀释100倍，过0.22 μm滤膜[7-8]，在上述“1.3色谱条件”下进样，得到各个有机酸的含量见表6。

表6 7种有机酸的含量

4 结 论

研究建立了高效液相色谱-紫外检测法测定浸铀酸液中7种有机酸的方法，包括色谱柱的选择，流动相种类及流速的选择，该方法对铀浸出液中的有机酸能够有效的进行分析，可以广泛的应用于微生物浸矿酸液中有机酸的检测。