红松不同部位精油的成分分析及抑菌活性

（东北林业大学 a.林学院；b.黑龙江省森林食品资源利用重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150040）

在现代食品工业中，人们通常采用各种包装技术和方法来保存食物，但是无论采用哪种技术方法，并不能保证微生物完全不存在，对于大多数食品通常使用防腐剂作为防御的第二防线，以延长食品的保质期。但是部分化学合成防腐剂具有一定的刺激性甚至致癌性，而天然防腐剂来源广泛且对人体危害较小。从植物中获取天然抗菌剂一直是近几年的研究热点，研究发现天然的植物精油抗菌效果明显，对多种耐药性菌株有明显的抑制作用，这可以进一步推进我国在天然防腐剂方面的研发，让人们不再因为食品防腐安全而担忧。

红松Pinus koraiensis为松科Pinaceae 松属的常绿乔木，是国家Ⅱ级重点保护野生植物，分布广，是东北地区主要的森林树种之一[1]。红松资源丰富，在东北东部林区以及林业局保存了天然的红松母树林。目前，关于提取方法对精油提取率影响的研究已有报道。包怡红等[2]采用波辅助-盐析-水蒸气蒸馏法提取黑皮油松松针精油，得出精油平均得率为0.388 2%。汤晓鸥等[3]使用复合酶法提取松针精油，该方法提取率比常规的方法高出37.9%。另外，徐丽珊等[4]用水蒸气蒸馏法证实了黄山松和湿地松松针的成分有所不同，但是他们均含有萜烯类化合物，这一点说明了萜类物质是大多数松针精油所共有的物质。另外，同一棵松树不同部位的精油的成分也有所不同。蒙琦等[5]利用气质联用和固相微萃取技术，对松塔挥发油成分进行分析，松塔中含量较高的是α-蒎烯（44.258%），其次是D-柠檬烯（23.426%）、β-蒎烯（8.674%）、石竹烯（3.462%）等。

近年来，国内外学者对松塔的化学成分及生物活性展开了大量研究工作，结果显示松塔中含有萜类、木质素类、多糖等多种化学成分[6]，并具有抗肿瘤、抗病毒[7]、抗菌、增强免疫力等生物活性，具有重要的药物开发前景。通过现代技术对松针成分分析，发现松针提取物富含糖类、粗蛋白、粗脂肪、氨基酸和多种矿物质元素、维生素、精油、酶及辅酶等活性物质[8-9]。松壳中含有木质素、芪类、挥发油、维生素类、棕榈碱、矿物质、多糖、蛋白质、脂肪与黄酮类等多种生物活性物质[10]。基于气相色谱法（GC）、液相色谱法和质谱法（MS）的研究已经报道了松仁的成分[11]，然而关于松针、松塔的成分却鲜有报道[12]。采用气相色谱-质谱联用技术，对红松不同部位挥发油的成分进行了测定和比较，并对3 种食源性细菌进行了抑菌活性研究。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材 料

红松松壳、松塔、松针：采于东北林业大学校园，将松壳、松塔、松针洗净、干燥、粉碎，过60 目筛，得到预处理产物。

1.1.2 仪 器

蒸汽灭菌锅（上海申安医疗器械厂），摇摆式高速万能粉碎机（温岭市林大机械有限公司），生化培养箱（上海齐欣科学仪器有限公司），电子天平（丹佛仪器有限公司），电热恒温转风干燥箱（上海恒科有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 松针、松塔、松壳前处理

选取新鲜无枯萎的红松松针、松塔、松壳，洗净后用高速多功能粉碎机将其粉碎，过标准检验筛，置于干燥箱中干燥以备用。

1.2.2 精油的提取

采用水蒸气蒸馏法[13]提取精油。称取红松松针、松塔、松壳粉末各100 g，置于2 000 mL 的圆底蒸馏烧瓶中，按照1:8 的比列加入蒸馏水，每100 g 粉末中加入0.5 g NaCl，连接好挥发油提取器与冷凝管，打开电热套开关进行水蒸气蒸馏提取得到3 种精油，经无水硫酸钠干燥后称重，按照精油得率为精油质量占粉末质量的百分比，计算3 种精油的得率。放置黑暗中4℃保存。

1.2.3 菌悬液的制备

大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌均来自中国东北林业大学实验室。细菌在牛肉膏蛋白胨培养基上活化培养[14]。

1.2.4 GC-MS 分析3 种精油的物质成分

精油的前处理：精确称取100 mg 的精油，以正己烷为溶剂定容于100 mL 容量瓶，过0.45 μm有机相微孔滤膜至气相进样瓶。

GC 条件：CP-Sil 88 毛细管柱（100.0 m×0.25 mm×0.20 μm）；He 载气；柱流量2 mL/min；进样口温度260℃；起始温度140℃；保持5 min；分流比20:1；进样量1 μL；离子源温度220℃。

MS 条件：EI 电离方式；离子源温度220℃；接口温度240℃；溶剂延迟时间4.5 min；分子质量扫描范围50～550 u；扫描时间0.5 s，扫描方式为全扫描；检索谱库DATABASE/NIST98.L。

1.2.5 3 种精油成分的定性与定量分析

采用气质联用仪中的NISTI4 谱库，自动检索分析组分的质谱数据，并对全部检索结果参考有关标准图谱和相关文献进行核对和补充，采用色谱峰面积归一化法，计算各组分的相对百分含量。

1.2.6 抑菌活性的测定

1）抑菌直径的测定。采用滤纸片扩散法测定抑菌圈直径[14]，用打孔器将滤纸片制成直径为6 mm 的小圆片，然后放入121℃灭菌锅中15 min杀菌。在超净工作台上，将培养基倒入平板中，约2 cm 厚，待其冷却凝固。用移液枪吸取制备好的菌悬液100 μL，均匀涂布在琼脂平板上，静置5 min，将滤纸片平铺在琼脂板上，每个培养皿贴3片，滤纸片间保持一定距离。用移液枪吸取10 μL精油滴在滤纸片上，以双抗作为阳性对照，吸取10 μL 双抗滴在滤纸片上。另外一个滤纸片滴加无菌蒸馏水作为阴性对照。以上操作均在无菌条件下进行。然后将培养皿置于37℃恒温培养箱中培养24 h，测量抑菌直径的大小，3 次平行，结果取重复实验平均值。

2）最低抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）。参考樊梓鸾、Mirjana 等[16-17]的方法经改进后采用二倍稀释法测定红松挥发油的最低抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC），对其抑菌活性进行定量分析，小试管一共27 只，分成3 组，121℃高压灭菌20 min，各编号1～9，在无菌条件下，加入4.5 mL 的液体培养基，然后向1～8 号试管中各加入0.5 mL 的菌悬液，用微量移液器分别移取50、25、12.5、6.3、3.2、1.6、0.8、0 μL 加入1～8 号试管中，9 号试管作为空白对照在冰箱中冷藏，其余24 只试管恒温震荡培养。从小试管中取50 μL 涂布在平板上，密封培养后拿出，观察各浓度培养皿上是否有菌生长。MIC值为培养24 h 不长细菌时的挥发油浓度[18]，MBC值为培养48 h 不长细菌时的挥发油浓度。

1.3 数据处理

试验中的测试均平行检测3 次。基础数据统计采用Excel 2019 软件，图表均采用Origin 9.0 处理完成，显著性分析采用SPSS 21.0 软件，图和表中不同字母表示两组数据之间存在显著性差异（P＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 红松不同部位精油的得率分析

图1列出了来自3 个不同部位（松针、松塔和松壳）的淡黄色精油的质量及其相应的得率。松针、松塔、松壳精油的得率分别为0.152%、0.243%、0.024%。

图1 红松不同部位提取的得率Fig.1 Yield of essential oil from different parts of Korean pine

2.2 红松不同部位精油GC-MS 定性和定量分析

在全扫描模式下，在GC/MS 上获得总离子电流（TIC）；红松不同部位精油样品的典型TIC如图2～4 所示。通过比较EI 质谱和质谱数据库（NIST11）的裂解模式，对大多数化合物进行了明确的鉴定；对于那些没有充分保证的化合物，鉴定是基于EI 和化学电离质谱的联合信息[19]。通过比较EI 质谱和我们实验室或文献资料中的真实化合物的裂解模式，进一步证实了其中的一些。

图2 红松松针精油的总离子流Fig.2 Total ion current of essential oils from different parts of Korean pine needle

图3 红松松塔精油的总离子流Fig.3 Total ion current of essential oils from different parts of Korean pine cone

图4 红松松壳不同部位精油的总离子流Fig.4 Total ion current of essential oils from different parts of Korean pine shell

定量用峰面积百分比表示。以气相色谱峰面积计算各组分相对含量，无需校正响应因子。从抽提面积看松针、松塔、松壳中挥发油的组分分别为84.61%、89.14%和81.03%。结果见表1，3种精油经过GC-MS 分析与NIST14 谱库进行了对比，其中化合物选取了相似度90%及以上的物质进行了定量分析。

2.3 红松不同部位精油成分分析比较

如表2所示，每种挥发油的组成均以萜类、醇类、酯类、酮类为主[20]，其中松针、松塔的萜类含量较高，分别为75.93%、66.25%。然而，松壳中萜类含量较少为5.23%。松针中主要的萜类是蒎烯（26.15%），主要的酯类是左旋乙酸冰片酯（13.08%）；松塔中主要的萜类是柠檬烯（22.67%），主要的酯类是5-甲基-2-(1-甲基乙烯基)-4-己烯-1-醇乙酸酯（14.13%）；松塔中主要的酮类是4-羟基-4-甲基-2-戊酮（39.62%），主要的酯类是酞酸二乙酯（12.99%）。其中蒎烯是一种合成香料的重要原料[21]，是无色透明液体，微溶于水，不溶于丙二醇、甘油，溶于乙醇、乙醚、氯仿、冰醋酸等多数有机溶剂。而柠檬烯[22]是一种植物精油,对引起肉类腐败的常见致腐菌有较为明显的抑制作用。此研究红松松壳成分与宗芳芳等[23]研究结果相似。

表1 红松不同部位精油成分的研究†Table 1 Composition of the essential oils from different parts of Korean pine

续表1Continuation of table 1

续表1Continuation of table 1

表2 红松不同部位精油的主要成分Table 2 Main compounds of the essential oils from different parts of Korean pine

2.4 3 种部位精油的抑菌活性

2.4.1 3 种部位精油的抑菌直径

由表3可得，这3 种不同部位的精油对于各种测试菌种均表现出一定的抑菌活性，抑菌直径在9.842～13.887 mm。红松松针精油对大肠杆菌的抑制效果最好（抑菌直径为13.887±0.07 mm），高于金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌，抑菌直径分别为12.813±0.65 mm、11.961±0.22 mm；松塔精油对大肠杆菌抑制效果最佳（抑菌直径为12.625±0.09 mm），抑制效果显著高于金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌，但两种测试菌抑菌直径相差不大，其抑菌直径分别为10.622±0.33 mm、10.476±0.45 mm；松壳精油对枯草芽孢杆菌抑制效果最佳（抑菌直径为10.975±0.47 mm），其次是大肠杆菌（抑菌直径为10.546±0.11 mm），对金黄色葡萄球菌抑制效果最差（抑菌直径为9.842±0.24 mm）。其中松塔和松针精油抑菌活性为大肠杆菌＞金黄色葡萄球菌＞枯草芽孢杆菌，而松壳精油的抑菌活性为枯草芽孢杆菌＞大肠杆菌＞金黄色葡萄球菌。由此可知不同部位精油抑菌效果不同。对于红松松针精油抑菌效果的结果与樊梓鸾等[16]研究结果一致。

2.4.2 3 种部位精油的最低抑菌浓度（MIC）

由表4可知，精油对各测试菌种均有抑菌效果，且MIC 值在1.6～6.4 μL/mL 范围内，不同部位精油作用于同一种供试菌有可能产生相同的抑菌效果。松针精油对大肠杆菌的MIC 值为1.6 μL/mL，抑菌效果最佳，金黄色葡萄球菌的MIC 值为3.2 μL/mL，枯草芽孢杆菌的MIC 值为6.4 μL/mL；松塔精油对大肠杆菌的MIC 值为3.2 μL/mL，另两种的MIC 值均为6.4 μL/mL；松壳精油对大肠杆菌的MIC 值为3.2 μL/mL，金黄色葡萄球菌的MIC 值为12.5 μL/mL，抑菌效果最差，枯草芽孢杆菌的MIC 值为6.4 μL/mL。

2.4.3 3 种部位精油的最小杀菌浓度（MBC）

由表5可知，松针精油对大肠杆菌的MBC值为3.2 μL/mL，金黄色葡萄球菌的MBC 值为6.4 μL/mL，枯草芽孢杆菌的MBC 值为12.5 μL/mL；松塔精油对大肠杆菌的MBC 值为6.4 μL/mL，另两种的MBC 值均为12.5 μL/mL；松壳精油金黄色葡萄球菌的MBC 值为12.5 μL/mL，枯草芽孢杆菌和大肠杆菌的MBC 值均为6.4 μL/mL。

表3 红松不同部位精油的抑菌直径†Table 3 Antibacterial diameter of essential oil from different parts of Korean pine mm

表4 红松不同部位精油最小抑菌浓度†Table 4 Minimum inhibitory concentration of essential oil from different parts of Korean pine

表5 红松不同部位精油最小杀菌浓度Table 5 Minimum bactericidal concentration of essential oil from different parts of Korean pine

由上述内容可知，红松3 种精油对供试菌种在试验浓度范围内均有抑菌效果，但不同部位的精油对不同供试菌的最低抑菌浓度和最小杀菌浓度不同，其MIC、MBC 值之间差异较大，红松的3 种部位的精油对革兰氏阴性菌的抑制效果（大肠杆菌）明显优于革兰氏阳性菌（金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌）的抑制效果，研究结果与抑菌圈测定结果基本一致。

3 讨 论

如今，人工添加剂在食品加工中所引发的安全问题逐渐被人们重视，因此从植物中获得的天然添加剂如佛手柑精油、柑橘精油和红松精油等更受到了人们的青睐[24]。此外，在医学领域中，从高抗菌性植物中提取的药物可以有效减少或避免抗生素治疗细菌感染性疾病所引起的健康问题。并且长期使用抗生素可能会造成耐药性而引起功能失调，而从植物中获得的新药可降低该问题发生概率。因此，红松作为一种天然的抗菌源，无论从食品领域还是医学领域，都具有广阔的开发前景。

利用GC-MS 法分析精油样品中的成分，从松针、松塔、松壳精油中分别鉴定出28、46、21 种成分，其中松针、松塔中萜类物质是松壳中萜类物质的11～15 倍。在松针、松塔精油中的酮类化合物含量较低，然而在松壳精油中酮类化合物却占近60%。并且所鉴定的某些成分的含量因提取的部位不同而有明显差异[25]。精油对各测试菌种均有抑菌效果，3 种精油的抑菌直径在9.842～13.887 mm，抑菌直径范围属于产生敏感效果范围内[26]，且MIC 值在1.6～6.4 μL/mL 范围内，不同部位精油对同一种供试菌可能会产生相同的抑菌效果。其中松针精油抑菌效果比松塔精油和松壳精油抑菌效果更佳，并且3 种部位的精油对革兰氏阴性菌抑制效果优于革兰氏阳性菌抑制效果。

红松分布广泛，药用价值高，因此具有很好的经济价值。目前，已有很多相关红松松针精油抑菌的报道，证明松针精油中的单萜类化合物和倍半萜类化合物具有保藏和杀菌作用。这可能是红松被广泛应用于医药、化妆品和食品工业等领域的原因[27]。另外，已有很多单独对红松松壳精油或松塔精油中的成分、抑菌效果等的研究，但是没有集中对红松松针、松壳和松塔精油成分及抑菌效果对比分析的研究。首次对红松不同部位的精油成分和抑菌效果进行研究和比较，发现不同部位精油的成分存在差异，这也决定了红松不同部位的精油抑菌效果不同[28]。抗菌实验结果表明3 种精油普遍对大肠杆菌具有很好的抑制效果并且松针精油抑菌效果优于松塔精油和松壳精油。但是由于精油化合物组成、测试菌株及测定方法等方面的差异使得研究结果还需要进一步深入研究。红松作为一种天然的抗菌源，其应用还有待于更多领域的探索，由于本研究尚未深入研究红松精油的抑菌机理，并且精油易挥发不稳定，下一步的试验中将要对红松精油进行包埋研究，并初步揭示红松精油的抑菌机理。

4 结 论

本试验通过对红松不同部位的精油成分和抑菌效果进行了研究和比较。采用GC-MS 法分析了不同部位精油的成分，结果表明3 种精油成分差异显著。通过对抑菌直径和抑菌最小浓度的分析，精油对于各种测试菌种均表现出良好的抑菌活性，其中红松松针精油抑菌效果最佳，且对大肠杆菌的抑菌圈直径最大。通过对红松的研究，从不同部位的精油成分、提取率、抑菌效果阐述了人工开发和利用红松精油作为天然抗菌剂的可能性。因此，下一步有必要对红松精油在食品添加剂尤其是抑菌方面的应用作深入的研究，从而为红松精油的综合利用提供一定的科学依据。