低盐胁迫对坛紫菜(Pyropia haitanensis)离子转运的影响

邢 磊，王文磊，徐 燕，纪德华，许 凯，陈昌生，谢潮添

(集美大学水产学院，福建 厦门 361021)

0 引言

坛紫菜(Pyropiahaitanensis)生长于潮间带地区，随着潮汐变化，经常会遭受各种生物和非生物胁迫。在干出和复水的过程中，盐胁迫是一种较为主要的胁迫因素。有研究[1]表明，紫菜能够在26～33的盐度范围下正常生长。关于紫菜响应高盐机制的研究较多。例如：Wang等[2]从转录组学研究入手，发现坛紫菜藻体叶状体可以通过提高能量代谢，合成脯氨酸、甜菜碱、海藻糖等物质，提高胞内渗透压以响应高盐胁迫；陈天翔等[3]运用非损伤微测技术(non-invasive micro-test technology，NMT)从离子流速的角度出发，通过阿米洛利(Amiloride，Na+/H+逆向转运蛋白抑制剂)和钒酸钠(Vanadate，H+质子泵抑制剂)对坛紫菜响应盐胁迫过程中钾钠平衡机制进行了研究，表明坛紫菜维持K+/Na+稳态的能力是其耐盐性的关键。

然而，目前关于紫菜等大型海藻应答低盐胁迫的研究主要集中在细胞存活率、光合活性以及离子含量等生理生化指标测定层面。例如：严兴洪等[4]的研究发现，当盐度低于19.6时，条斑紫菜(Prophyrayezoensis)叶状体的营养细胞存活率显著降低；而羊栖菜(Hizikiafusifarme)[5]在低盐浸泡的最初阶段(15 min内)，Na+离子含量显著下降，并且灰分干重比显著下降，可见在低盐浸泡的初期阶段，无机离子流失较快；文献[6]研究表明，坛紫菜在遭受淡水胁迫后，藻体Fv/Fm随胁迫时间的增加而显著下降，同时藻体内Na+和脯氨酸含量急剧下降以维持细胞内与水环境的渗透压平衡。此外，与Na+含量的快速下降相比，藻体内的K+含量虽有降低，但仍能维持在较高水平，而且与藻体光合作用呈显著正相关。但在低盐胁迫下，坛紫菜如何维持离子稳态，与高盐胁迫又有何异同点尚不明确。因此，本实验利用非损伤微测技术，通过外源添加阿米洛利和钒酸钠进行K+、Na+、H+离子流速测定，从离子动态转运角度研究低盐胁迫对离子转运的影响，以进一步完善对紫菜耐受低盐机制的认识。

1 材料与方法

1.1 实验材料及处理

实验材料：坛紫菜Z-61品系叶状体，材料取自福建省坛紫菜种质资源库[7]。

培养条件：温度21 ℃，光照强度50～60 μmol·m-2·s-1，昼夜周期为12 h，每隔1 d更换新鲜的培养液。选取表面光滑，披针形，无破损、卷曲、烂叶的8～15 cm的叶状体进行后续实验。

低盐营养液配置：取实验室正常海水(对照组，盐度30，记为S30组)加蒸馏水稀释至盐度5(记为S5组)[5]，充分搅拌均匀，高温煮沸消毒后冷却至21 ℃备用。蒸馏水盐度为0。

药理学处理：将坛紫菜叶状体置于添加100 μmol 阿米洛利或200 μmol 钒酸钠[3]的低盐溶液中进行胁迫处理。

1.2 实验方法

采用非损伤微测技术(NMT,Younger USA LLC,Amherst,MA)测定净H+、Na+、K+流速。配置标准溶液，制作微电极，测定空白组5 min，等待机器稳定。样品经过药理学处理后，测量前取叶状体在平衡液中平衡1 min。参照文献[8]的方法配置标准溶液和测量溶液，溶液浓度配方见表1。H+、K+、Na+离子测定方法为：处理15 min，在测试液中平衡1 min后进行测定。每株测定12 min，每个处理设6个重复。

表1 校正液、测试液配方及浓度

1.3 数据统计分析

采用Excel、Graphd prism 7.0以及SPSS 17.0对数据进行差异性分析和作图。根据单因素方差分析方法(one-way ANOVA，LSD)比较不同处理间数据的差异性，P<0.05为显著性差异。

2 实验结果与分析

2.1 低盐胁迫对坛紫菜藻体Na+流速和流向的影响

低盐胁迫对坛紫菜藻体Na+流速和流向的影响如图1所示：在正常状态下(S30组)，Na+呈现内流趋势(见图1a)；S5组加入阿米洛利和钒酸钠并不能降低Na+的外排(见图1b、c)；S30组、S5组、S5+Amiloride组、S5+Vanadate组的Na+平均流速分别为-1129.22，-178.11，-32.77，19.12 pmol·cm-2·s-1(见图1d)。

2.2 低盐胁迫对坛紫菜藻体K+流速和流向的影响

低盐胁迫对坛紫菜藻体K+流速和流向的影响如图2所示：在正常状态下(S30组)，K+呈现内流趋势，表明叶状体在正常状态下会吸收K+(见图2a)；在低盐胁迫下(S5组)K+内流受到显著抑制(见图2a)，但外排速度显著低于S30组，K+/Na+较高；在盐度5下添加阿米洛利能导致K+显著外排，添加钒酸钠对K+流速无显著影响(见图2b、c)；S30组、S5组、S5+Amiloride组、S5+Vanadate组的K+平均流速分别为-269.77，-58.54，268.02，44.36 pmol·cm-2·s-1(见图2d)。

2.3 低盐胁迫对坛紫菜叶状体H+流速和流向的影响

如图3所示：在正常状态下，H+在内流和外排之间进行波动，低盐胁迫会导致H+内流(见图3a)；与S5组相比，添加钒酸钠后会导致H+显著外排(见图3c)，但添加阿米洛利对H+流速无显著影响(见图3b)；S30组、S5组、S5+Amiloride组、S5+Vanadate组的H+平均流速分别为0.02，-0.11，0.06，0.85 pmol·cm-2·s-1(见图3d)。

3 讨论

在低盐胁迫下，叶状体遭受严重的低渗胁迫，由于细胞内外存在较高的浓度差，会不可避免地导致离子损失。无机离子作为一种细胞质的重要组成部分，不仅起到维持细胞渗透势的作用，还广泛参与细胞各类生命活动。细胞内离子平衡的稳态是活细胞维持生理作用的基础，K+/Na+平衡对许多细胞溶质酶的活性、维持膜电位、调节细胞大小以及维持渗透压至关重要[9]。文献[3]发现：高盐条件下，过多的Na+进入坛紫菜细胞，产生Na+毒害，并导致质膜去极化，激活质膜H+-ATPase驱动Na+/H+逆向转运蛋白，将多余的Na+从细胞质外排到质外体，并且通过抑制去极化激活的外向整流K+通道缓解K+外泄，从而维持叶状体K+/Na+平衡；而坛紫菜在遭受低盐胁迫后，短期内会迅速降低Na+含量，但会维持较高的K+水平，从而导致叶状体维持较高的K+/Na+。然而，低盐胁迫下叶状体如何维持K+、Na+稳态，高盐、低盐下坛紫菜维持离子稳态的机制是否相同尚不得知。因此，通过添加阿米洛利和钒酸钠的药理学实验，利用NMT探究离子通道在细胞响应坛紫菜离子平衡中的作用。其中，非损伤微测技术(NMT)可以实时测量进出活体材料的离子或小分子流速，被广泛应用于逆境、营养、发育、植物/微生物互作、光合/呼吸等领域，在盐胁迫中有较高的运用[10-11]。

盐生植物能利用Na+运输来高效调节渗透压。在藜麦(ChenopodiumquinoaWild.)的研究[12]中发现，藜麦会优先将Na+作为便捷的渗透压调节剂。本研究也发现，坛紫菜在正常状态下吸收Na+以维持自身稳态，但低盐胁迫下坛紫菜叶状体可快速外排Na+以应答外部低渗胁迫环境(见图1)。Na+在植物细胞中的积累是胞外Na+通过离子通道流入与Na+/H+逆向转运蛋白等通道的流出相平衡的结果。在高盐胁迫下，过表达拟南芥(Arabidopsisthaliana)AtSOS1可以有效降低植株Na+含量[13]。以上结果表明，盐胁迫下植物Na+外排主要是Na+/H+逆向转运蛋白作用的结果。在条斑紫菜的相关研究[14]中发现，PySOS1和PyNhaD(Na+/H+逆向转运蛋白)在条斑紫菜的pH调节和Na+稳态过程中发挥着重要的作用。在坛紫菜的转录组学研究中同样筛选到编码Na+/H+逆向转运蛋白的基因[2]，但其功能尚待进一步验证。文献[3]表明，盐度110下，坛紫菜叶状体Na+大量外排，且流速基本维持在20 000 pmol·cm-2·s-1左右，加入阿米洛利能够显著抑制Na+的外排，证实了高盐胁迫下坛紫菜Na+/H+逆向转运蛋白的排Na+功能。而本研究中，在低盐胁迫下，坛紫菜叶状体同样能通过Na+的外排来积极适应外界的渗透环境(见图1a)；在盐度5的基础上加入阿米洛利后，并不能显著抑制坛紫菜叶状体Na+的外排(见图1d)。这表明低盐下叶状体Na+的外排方式可能和高盐不一致，可能通过非选择性阳离子通道外排至细胞外[15-16]。

耐盐植物在盐胁迫条件下可以维持较高的K+含量以保持酶活性[9,17]，保证生物代谢活动正常进行。将LeNHX2基因导入番茄(Solanumlycopersicum)后，能够改善盐胁迫下K+的流失，进而增强耐盐性[18]。生长于低盐中的长囊水云(Ectocarpussiliculosus)能够减少Na+，维持K+以应对水中渗透压的变化[19]。低盐胁迫会导致龙须菜(AsparagusschoberioidesKunth)细胞间孔状联系受到破坏，但低盐胁迫对龙须菜细胞内K+含量影响不大，表明龙须菜具有较强的耐低盐性[20]。以上研究均表明，盐胁迫下维持较高的K+离子含量对植物耐盐起着至关重要的作用。文献[3]发现，低盐胁迫下坛紫菜叶状体内的K+含量虽有流失但仍维持在较高水平，显著高于高盐胁迫下叶状体的K+含量，初步说明在低盐条件下坛紫菜叶状体具有更强的保K+能力。进一步通过转录组分析发现，K+外向通道在低盐胁迫下并未出现差异表达[2]，同时，添加TEA抑制K+外向通道以及添加钒酸钠抑制质膜质子泵活性后，坛紫菜叶状体的K+含量均为未发生明显变化[3]。这说明低盐条件下坛紫菜叶状体内的K+并不是通过去极化激活的外向通道流失的，与坛紫菜应答高盐胁迫过程中K+流失方式有所区别，有可能是通过非选择性阳离子通道流失。但由于缺少特异抑制剂，本研究并未添加相应离子通道抑制剂测定藻体K+流速变化。正常状态下，坛紫菜为了维持自身渗透压和离子平衡，会吸收K+；低盐胁迫下添加质膜H+-ATPase抑制剂钒酸钠后，对K+离子的外排并无显著影响(见图2c)。这初步说明质膜H+-ATPase对K+在低盐下的运输并无显著作用。S5组在低盐胁迫下，坛紫菜K+虽有微弱流失(见图2a)，但显著低于高盐胁迫条件下的K+外排幅度。这表明坛紫菜具有较强的保K+能力。低盐胁迫下较强的维持K+稳定的能力使坛紫菜具有较高的K+/Na+比，保证了坛紫菜较强的耐低盐性。

此外，H+-ATPase是一种广泛存在于植物各个细胞膜中的重要蛋白[21]，质膜H+-ATPase能够为跨膜运输提供能量[22]，从而为Na+/H+逆向转运蛋白提供驱动力。大量研究[23-24]表明在不同物种中质膜H+-ATPase有助于Na+外排。文献[3]发现，高盐胁迫下，H+呈现外排趋势，从而驱动Na+/H+逆向转运蛋白外排Na+，同时，缓解质膜去极化进而减少K+通过外向通道流失。但在低盐胁迫下， H+微弱内流(见图3)，进一步表明坛紫菜响应低盐胁迫和高盐胁迫之间存在显著差异。

4 结论

坛紫菜叶状体在低盐胁迫下通过快速排出Na+离子，以积极应对外界低渗环境；同时，低盐胁迫下K+虽然有一定的流失，但显著低于高盐胁迫下的K+外排幅度。这表明坛紫菜叶状体具有较强的保K+能力，因此能够维持较高的细胞内K+/Na+比，从而提高坛紫菜叶状体抵抗低盐胁迫的能力。进一步分析发现，坛紫菜叶状体排Na+保K+过程并不是质膜Na+/H+逆向转运蛋白和质膜H+-ATPase共同作用的结果。因此，高盐胁迫和低盐胁迫条件下，坛紫菜叶状体采取不同机制来维持离子平衡。本研究为阐明坛紫菜叶状体的耐低盐机理提供了新的依据和见解。