基于InDel标记的黄瓜种质资源遗传多样性分析

卢霞　刘梦华　邓志军　孙秋月　夏迎春　李文虎　司龙亭　阿门

摘要：为明确黄瓜（CucumissativusL.）自交系间的亲缘关系，筛选适宜作为杂交亲本的种质资源，利用InDel标记对48份黄瓜自交系进行遗传多样性分析。结果表明，68对InDel标记中39对标记具有强多态性，在48份材料中共检测出79个等位基因，平均每对标记检测到2.0256个等位基因，遗传距离在0～0.9551范围之间，相似性系数在0.44～1.00之间，平均相似性系数为0.72，说明48份材料总体亲缘关系较近，遗传多样性不够丰富。NTSYS2.1软件聚类结果表明，在相似性系数为0.44时，48份材料被划分为两大类群，主要为密刺黄瓜和水果黄瓜，用PowerMarker3.25软件进行树状图分析，分析结果与NTYSYS聚类结果一致。研究结果可为了解黄瓜种质资源遗传背景及亲本组合的选配奠定基础。

关键词：黄瓜种质资源;InDel标记;遗传多样性分析;多态性分析;聚类分析

中图分类号：S642.202文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2021）01-0049-05

作者简介：卢霞（1991—），女，甘肃天水人，硕士，助理研究员，主要从事分子标记辅助育种与种子纯度鉴定。E-mail：1344963751@qq.com。

通信作者：阿门，博士，副研究员，主要从事作物遗传育种研究。E-mail：2582259972@qq.com。

黄瓜（CucumissativusL.，2n=14）是葫芦科甜瓜属一年生蔓生植物，是一种世界性栽培蔬菜。黄瓜在我国已有2000多年的栽培历史，已成为我国主要栽培蔬菜之一[1]。经过长时间的自然和人工选择，黄瓜材料间的遗传背景极其相似，栽培黄瓜品种的遗传变异显著减少，品种间的遗传多样性远低于同属的甜瓜[2-5]，使黄瓜的形态鉴定容易受到环境因素的影响。因此，明确育种材料的遗传多樣性和亲缘关系已成为黄瓜育种的重要工作之一。

传统育种方法很难满足黄瓜遗传改良发展的需求，目前，分子标记是进行黄瓜种质遗传多样性及亲缘关系分析的有效工具。近年来，为了更好地鉴别黄瓜，各种基于DNA的分子标记被开发出来。限制性内切酶片断长度多态性（RFLP）、扩增片断长度多态性（AFLP）、简单重复序列标记（SSR）、表达序列标签-简单重复序列标记（EST-SSR）、单核苷酸多态性（SNP）等现代分子标记技术已在黄瓜遗传育种中得到应用。Dijkhuizen等利用RFLP分子标记方法对16个黄瓜品种进行遗传多样性分析并将聚类结果与同工酶标记聚类结果进行对比，结果表明RFLP分子标记聚类结果与同工酶标记聚类结果一致[6]。李锡香等通过AFLP分子标记对70多份黄瓜材料进行遗传多样性研究，将70份材料聚类为西双版纳黄瓜、野生黄瓜和栽培黄瓜三大类群[7]。穆生奇等利用SSR分子标记技术对59份黄瓜材料进行遗传多样性分析，结果表明59份黄瓜材料被划分到7个类群当中[8]。刘俊青等用EST-SSR标记评价了21份不同生态类型黄瓜种质的遗传多样性，21份黄瓜种质可分为两大类群[9]。姚丹青等利用42个SNP位点进行黄瓜遗传多样性分析，结果表明，42个SNP位点中有30个位点的多态信息量为0.027～0.528，71个黄瓜品种两两间的遗传相似系数分布在0.4032～0.9809之间[10]。

基于全基因组重测序开发的插入/缺失[Insertion/Deletion（InDel）]标记是指2个亲本间在全基因组序列中的差异。InDel标记因其具有在基因组内分布广、密度高、变异稳定、多态性强、检测容易等优点[11-12]，受到越来越多的关注，在生物遗传多样性、品种纯度鉴定、亲缘关系鉴定以及分子育种上都有重要的应用价值[12-16]。本研究利用江苏绿港现代农业发展有限公司（江苏绿港）育种研究所提供的48份黄瓜自交系，采用基于绿美1号父母本全基因组重测序开发的InDel标记，鉴定了黄瓜种质资源遗传多样性及亲缘关系，旨在为黄瓜种质资源收集和保存提供参考，指导在育种中合理选择选配亲本，从而减少育种的盲目性加快育种进程。

1材料与方法

1.1材料

供试材料选自江苏绿港现代农业发展有限公司（江苏绿港）育种研究所提供的48份黄瓜自交系（表1），代号为D1～D23、X1～X18、B1～B7。

1.2方法

1.2.1黄瓜基因组DNA的提取

2020年3月6日将供试材料播种于江苏绿港育苗棚中，待长至2～3张真叶时取样，用改良的十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法提取黄瓜基因组DNA。具体提取步骤如下：（1）取新鲜叶片30mg放入2mL的离心管中，加入1个直径4mm的钢珠，盖紧盖子，将其放入液氮中60s，然后利用组织研磨仪磨样80s;（2）磨好样后，加入600μLCTAB提取液，55℃水浴15min，每隔5min上下翻转混匀1次;（3）12000r/min离心5min，吸取400μL上清于干净的1.5mL离心管中，加入250μL三氯甲烷和异戊醇混合物（24三氯甲烷∶[KG-*3]1异戊醇），充分混匀;（4）13000r/min离心90s，取300μL上清于另一个新的1.5mL离心管中，加入在-20℃条件下提前预冷的无水乙醇600μL，混匀，-20℃冰箱放置1h;（5）12000r/min离心5min，倒掉上清液，室温放置;（6）待离心管中无乙醇味时，加入100μLddH2O溶解DNA。分别用超微量紫外可见分光光度计（DeNovixDS-11）和1%琼脂糖凝胶电泳检测所提DNA的浓度和质量，放-20℃冰箱存放备用。

1.2.2PCR扩增与检测

PCR反应体系为25μL，其中12.5μL2×TaqMasterMix（康为世纪），10μmol/L正反引物各1μL，DNA模板1μL，ddH2O补至25μL。PCR反应程序为94℃预变性2min;94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环;72℃延伸2min，16℃结束反应。扩增产物用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。

1.3数据分析

统计电泳结果，利用PowerMarker3.25软件分析每个标记所产生的等位基因数、有效等位基因频率、杂合度、基因多样性和多态性信息含量（PIC）等;用NTSYS2.1软件进行遗传相似系数计算，同时用2种软件中的UPGMA方法进行树状图分析及聚类分析。

2结果与分析

2.1InDel标记多态性分析

从笔者所在实验室前期开发出的10470个InDel标记中初步选择68对InDel标记对48份黄瓜自交系进行分析，结果显示，39对InDel标记具有强多态性，共扩增出79条多态性条带，平均每对标记产生2.0256个多态性条带。标记InDel250对48份黄瓜种质材料扩增出2个等位基因的电泳（图1）。48份黄瓜自交系中平均等位基因位点为2.0256，观察的48份黄瓜自交系的杂合度为0～0.2083，标记InDel161的杂合度最高，为0.2083，标记InDel269的基因多样性最高，扩增出3条带，为扩增带型数量最多的标记，且该标记扩增结果的多态性含量PIC值最高，为0.5246（表2）。

2.2基于InDel标记的黄瓜种质遗传多样性分析

在48份黄瓜种质资源中，遗传距离的范围在0～0.9551之间，其中D2与D3，D5与D18，D9与D11，D4与D15、D16的遗传距离为0，说明这些材料可能为同一种质资源，而X1与X2遗传距离最大，达到0.9551，为比较理想的亲本组合。利用NTSYS2.1软件分析发现，48份黄瓜材料相似性系数变幅为0.44～1.00，平均相似性系数为0.72，说明其亲缘关系较近，遗传多样性不够丰富，遗传背景相对狭窄。

采用NTSYS2.1软件中的UPGMA对48份黄瓜种质资源进行聚类分析作图，结果见图2。在相似性系数为0.44时，将黄瓜种质划分为2个类群，第1类群包括D1、D2、D3、D12、D5等31份材料，且大部分密刺黄瓜被聚为此类;第2类群包括X1、X3、X7、X4、X11等17份材料，且该类群76.5%为水果黄瓜;白绿黑刺黄瓜、白绿稀刺黄瓜全部在第一大类群，2份白绿无刺黄瓜在第二大类群。为了验证NTYSYS软件的分析结果，用PowerMarker3.25软件进行聚类分析，发现48份黄瓜自交系也是被聚为两大类群（图3），且聚类结果与上述NTSYS软件分析结果完全一致。

3讨论

近年来，分子标记因其不受环境条件影响而作为作物遗传多样性及亲缘关系分析的有效工具。在黄瓜遗传多样性研究中，用RFLP、AFLP、SSR、EST-SSR、SNP等标记对黄瓜种质的研究较多，虽然InDel标记具有在基因组内分布广、密度高、变异稳定、多态性强、容易检测等优点，但其在黄瓜种质研究中的报道较少。本研究选用68对InDel标记对48份黄瓜自交系进行遗传多样性分析，研究黄瓜种质的亲缘关系，为育种者提供相关有效信息。研究发现39对InDel标记具有强多态性且扩增带型清晰，占所选标记的57.4%;39对标记在48份材料共检测出79个等位基因，平均每对标记检测到2.0256个等位基因，遗传相似性系数在0.44～1.00之间，平均相似性系数为0.72，说明48份材料总体亲缘关系较近，遗传多样性不够丰富，该结果与相关报道的黄瓜遗传背景狭窄研究结果[2，4，9]一致。

本研究利用UPGMA聚类分析，在相似性系数为0.44时，将48份供试黄瓜材料分为两大类群，第一大类群包括大部分的刺密黄瓜，而第二大类群主要为水果黄瓜。在第一类群中刺密黄瓜D2与D3，D5与D18，D9与D11，D4与D15、D16的相似性系数高达1，遗传距离为0，说明这些黄瓜材料遗传背景更为相似，可归为同一品系，表型上的差异可能为环境条件影响所致，也可能是因为本研究所选用的InDel标记与表型无直接关系。除去遗传距离为0的材料外，其他种质资源的遗传距离在0.0064～0.9551范围内。此外，本研究中白绿黑刺黃瓜、白绿稀刺黄瓜，白绿无刺黄瓜分布在两大类型中，表明它们的基因组可能是由密刺黄瓜和水果黄瓜变异而来，从该研究结果中可以很清晰地了解所选黄瓜材料的遗传背景，指导育种人员进行杂交组配。水果黄瓜绿美1号的父母本X1、X2被划分到不同类群中，且X1与X2的遗传距离最大，二者的亲缘关系较远，且生产上绿美1号的品质和产量均优于亲本，说明绿美1号双亲间存在杂种优势，类似的研究在水稻、胡萝卜、玉米等作物上也有报道[17-19]，本研究首次从分子水平上揭示了亲本材料的遗传差异与黄瓜杂种优势的关系，为黄瓜育种和改良奠定了理论基础。

本研究对48份黄瓜种质资源进行遗传多样性分析，聚类分析揭示了黄瓜种质间的亲缘关系，将指导育种中合理选择亲缘关系较远的种质进行杂交组合的配置，提高优良组合选育，从而减少育种的盲目性，加快育种进程。

参考文献：

[1]余冰，郑志华，孔令云，等.加工黄瓜的标准化与质量控制[J].中国农学通报，2007，23（3）：109-112.

[2]MlikiA，StaubJE，SunZY，etal.Geneticdiversityinmelon（CucumismeloL.）：anevaluationofAfricangermplasm[J].GenetResourCropEvol，2001，48（6）：587-597.

[3]Lopez-seseAI，StaubJE，Gomez-guillamonML.GeneticanalysisofSpanishmelon（CucumismeloL.）germplasmusingastandardizedmolecularmarkerarrayandgeographicallydiversereferenceaccessions[J].TheorApplGenet，2003，108：41-52.

[4]StaubJE，Lopez-seseAI，FanourakisN.Diversityamongmelonlandraces（CucumismeloL.）fromGreeceandtheirgeneticrelationshipswithothermelongermplasmofdiverseorigins[J].Euphytica，2004，136（2）：151-166.

[5]EscribanoS，LazaroA，CuevasHE，etal.Spanishmelons（CucumismeloL.）oftheMadridprovenance：auniquegermplasmreservoir[J].GenetResourCrop&Evol，2012，59（3）：359-373.

[6]DijkhuizenA，KermardWC，HaveyMJ，etal.RFLPvariationandgeneticrelationshipsincultivatedcucumber[J].Euphytica，1996，90（1）：79-87.

[7]李錫香，朱德蔚，杜永臣，等.黄瓜种质资源遗传多样性及其亲缘关系的AFLP分析[J].园艺学报，2004，31（3）：309-314.

[8]穆生奇，顾兴芳，张圣平，等.栽培黄瓜种质遗传多样性的SSR鉴定[J].园艺学报，2008，35（9）：1323-1330.

[9]刘俊青，李佩芳，胡建斌，等.用EST-SSR标记评价21份黄瓜种质的遗传多样性[J].河南农业大学学报，2011，45（6）：657-661.

[10]姚丹青，楼坚锋，朱文莹，等.基于SNP的黄瓜遗传多样性分析[J].上海农业学报，2017，33（1）：21-30.

[11]潘存红，王子斌，马玉银，等.InDel和SNP标记在水稻图位克隆中的应用[J].中国水稻科学，2007，21（5）：447-453.

[12]张红梅，翟文，金海军，等.利用InDel标记分析23份黄瓜种质[CM（25*2/3]的遗传多样性及核心种质资源筛选[J].上海农业学报，2019，35（4）：28-33.

[13]青阔，张桂华，王永，等.基于InDel标记快速检测黄瓜津优38种子纯度[J].种子，2011，30（6）：19-23.

[14]吴迷，汪念，沈超，等.基于重测序的陆地棉InDel标记开发与评价[J].作物学报，2019，45（2）：196-203.

[15]胡陶铸，林丽，胡继军，等.利用InDel标记构建番茄新品种指纹图谱[J].上海交通大学学报（农业科学版），2019，37（2）：24-29.

[16]聂京涛，李晓丹，姚永康，等.用于黄瓜白粉病抗性鉴定的InDel标记[J].中国蔬菜，2015，1（9）：26-30.

[17]PhetmanysengX，XieF，HernandezJE，etal.HybridriceheterosisandgeneticdiversityofIRRIandLaorice[J].FieldCropsResearch，2010，117：18-23.

[18]JagozB.TherelationshipbetweenheterosisandgeneticsdistancebasedonRAPDandAFLPmarkersincarrot[J].PlantBreeding，2011，130（5）：574-579.

[19]杨亚桐，董安忆，刘松涛，等.基于SSR分子标记的糯玉米遗传多样性研究[J].江苏农业科学，2020，48（2）：83-86.