高粱组Ⅲ WRKY 转录因子对干旱胁迫的表达分析

（中国热带农业科学院湛江实验站/广东省旱作节水农业工程技术研究中心，广东 湛江 524013）

【研究意义】高粱（Sorghum bicolor）是禾本科高粱属1 年生草本植物，不仅是世界上重要的粮食和能源作物，也是优质的饲料作物。高粱具有耐旱、耐涝、耐盐碱等多种特性［1］，其基因组较小（约750 Mb），具有丰富的遗传多样性，其优良的基因资源在作物改良中具有广阔的应用前景［2］。转录因子又称反式作用因子，对转录过程起诱导或抑制作用［3］。WRKY 转录因子作为植物中一类重要转录因子，广泛参与植物生长发育、响应激素诱导和生物及非生物胁迫等生物学进程［4］，开展高粱WRKY基因耐旱性表达特征分析具有重要意义，可为高粱WRKY基因的功能研究奠定基础。【前人研究进展】WRKY基因家族作为高等植物中备受关注的基因家族之一，自第一个WRKY 转录因子基因从甘薯中克隆以来［5］，随着许多物种基因组测序工作完成，越来越多的WRKY基因从基因组水平上鉴定出来，已在青稞［6］、中粒咖啡［7］、大麦［8］和杨树［9］基因组分别鉴定了41、49、98、122 个WRKY基因。WRKY 转录因子包含1～2 个保守WRKY 结构域，结构域由约60 个氨基酸序列组成，其保守的7 个核心氨基酸序列为“WRKYGQK”。根据WRKY保守结构域数目和锌指结构类型，可将WRKY 转录因子分为组Ⅰ、组Ⅱ和组Ⅲ三大类，其中组Ⅱ又分为5 个亚类（Ⅱa～Ⅱe）。组ⅠWRKY 转录因子包含2 个WRKY 结构域，其锌指结构的氨基酸类型为C2H2，组Ⅱ和组Ⅲ转录因子只含有1 个WRKY 结构域，锌指类型分别为C2H2、C2HC 型［10］。据报道，WRKY 转录因子参与了植物生长发育的许多进程，如开花［11］、次级代谢物合成［12］和衰老［13］等。也有较多研究表明，WRKY 转录因子响应各种压力胁迫，如玉米ZmWRKY62-like基因响应盐和干旱胁迫［14］；小麦TaWRKY33受盐胁迫诱导表达，TaWRKY33转基因拟南芥比对照具有更好的耐盐性［15］；甜高粱SSWRKY28、SSWRKY76基因的表达结果表明，它们可能在应答干旱胁迫时发挥一定作用［16］；高粱SbWRKY30基因通过影响拟南芥和水稻的根系结构来提高对干旱胁迫的耐受性，拟南芥和水稻的转基因植株在干旱胁迫后脯氨酸含量、SOD、POD 和CAT 酶活性高于野生型植株，而MDA 含量低于野生型植株［17］。【本研究切入点】前人研究结果表明，组ⅢWRKY 成员广泛参与植物生长发育进程、生物和非生物胁迫应答反应［18］。赵兴奎等［19］已从高粱基因组鉴定了16个组ⅢWRKY成员，但没有研究其响应逆境胁迫的表达谱。【拟解决的关键问题】本研究以高粱品种BTx623 为试材，采用PEG6000 溶液模拟干旱胁迫［20-21］，研究高粱组ⅢWRKY成员响应干旱胁迫的表达谱，为挖掘耐旱候选基因提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试高粱品种为BTx623，由广东省旱作节水农业工程技术研究中心保存，该材料有参考基因组序列，为中等耐旱性材料［22］。高粱组ⅢWRKY基因信息来自参考文献［19］，基因序列下载 自Phytozome（https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）。

主要试剂：TransZol Plant 植物总RNA 纯化试剂盒、Trans2K® Plus DNA Marker、TransStart®Top Green qPCR SuperMix，购自北京全式金生物技术有限公司；ThermoScientific 反转录试剂盒K1622，购自Thermo Fermentas 公司。

1.2 试验方法

1.2.1 干旱胁迫处理 供试高粱种子用1%（W/W）NaClO 溶液浸泡10 min，然后用灭菌的蒸馏水冲洗干净，采用 0.5×Hoagland 营养液水培，植株在植物光照培养箱中培养，生长条件为28 ℃、12 h 光照、12 h 黑暗，光照强度为9600 lx。营养液每2 d 更换1 次，待植株生长至3 叶期，用含20%（W/W）PEG6000 的营养液水培，模拟干旱胁迫处理，于处理后0、1、3、6、12 h 收集整株植物，每个样本混合6 株植物，每个时间点取3个生物学重复样本。

1.2.2SbWRKY基因的表达谱分析 从NCBI 数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov）下载有关干旱胁迫的高粱28K 芯片表达数据（GSE48205），利用GeneSpring GX 11.5软件（安捷伦科技有限公司）进行分析，获得探针的相对表达倍数，计算log2（fold change）值，然后根据探针对应的基因编号，整理基因的相对表达值。

1.2.3 总RNA 提取、cDNA 合成及荧光定量表达分析 采用植物总RNA 纯化试剂盒提取植株总RNA，对总RNA 用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测RNA 完整性；以总RNA 为模板，使用反转录试剂盒获得cDNA，所用Marker 为Trans2K® Plus DNA Marker。以cDNA 为模板使用qRT-PCR Mix按照操作说明配制反应体系，在LightCycler480 Ⅱ实时荧光定量PCR 仪上进行反应，内参基因选用高粱GAPDH基因。PCR 反应体系（10 μL）：cDNA 1 μL，2×Mix 5 μL，上游引物、下游引物（表1）各0.25 μL，补ddH2O 至10 μL；PCR扩增程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 35 s，35 个循环。

1.2.4 qRT-PCR 结果统计分析 按照2-ΔΔCT法计算基因相对表达值［23］。使用EXCEL 的student’s T检验进行差异显著性分析。

表1 高粱组Ⅲ WRKY 基因的qRT-PCR 扩增所用引物序列Table 1 Primer sequences for qRT-PCR amplification of Group III WRKY genes of sorghum

2 结果与分析

2.1 总RNA 完整性检测

为保证反转录和qRT-PCR 试验顺利开展，本研究对提取的15 个总RNA 样本进行琼脂糖凝胶电泳检测，其完整性较好（图1），可用于后续试验。

2.2 SbWRKY 的基因芯片分析结果

为研究高粱响应干旱胁迫的表达特征，从NCBI 数据库下载的高粱28K 芯片（GSE48205）包含对照、干旱胁迫、热胁迫和复合胁迫（干旱胁迫和热胁迫共同处理）共4 组表达值，将表达值导入GeneSpring GX 11.5 软件，经数据过滤、标准化处理、重要性分析和差异分析等流程，最后筛选得到4 个组ⅢSbWRKY基因的差异表达倍数值（表2）。由结果可知，SbWRKY14、SbWRKY32下调表达；SbWRKY39在干旱、热胁迫时下调表达，但在复合胁迫时上调表达；SbWRKY41在3 种胁迫处理时均上调表达。

图1 15 个RNA 样本的琼脂糖凝胶电泳检测Fig.1 Detection of 15 RNA samples by agarose gel electrophoresis

表2 不同非生物胁迫下高粱SbWRKY 基因表达值Table 2 Expression values of SbWRKYs in sorghum under different abiotic stresses

2.3 SbWRKY 基因的qRT-PCR 分析结果

为研究组ⅢSbWRKY基因响应干旱胁迫的表达谱，采用PEG6000模拟干旱胁迫于不同时间点取样，通过qRT-PCR分析基因处理与对照之间的相对表达值，在16个组Ⅲ成员中成功获得了12个基因的表达谱（图2）；各基因在干旱胁迫处理后不同时间点与对照（0 h）相比，SbWRKY10在处理后3、6 h下调表达，而在处理后12 h上调表达；SbWRKY14在处理后1、6、12 h下调表达；SbWRKY16、SbWRKY38、SbWRKY41和SbWRKY42在处理后1、3、6、12 h均下调表达；SbWRKY17在处理后1、6、12 h下调表达；SbWRKY39和SbWRKY89在处理后1、3、12 h下调表达；SbWRKY53在处理后1、12 h下调表达，而在6 h上调表达；SbWRKY75在处理后1 h下调表达，而在3、6、12 h上调表达；SbWRKY93在处理后6 h上调表达。

图2 干旱胁迫下12 个SbWRKY 基因的表达谱Fig.2 Expression profiles of 12 SbWRKY genes under drought stress

3 讨论

WRKY 转录因子在响应各种非生物胁迫方面已有相关报道，WRKY 转录因子在植物对干旱胁迫的响应中起重要作用［24］。在拟南芥中过表达TaWRKY1和TaWRKY33激活了几个与逆境相关的下游基因，提高了拟南芥在各种胁迫下的萌发率，促进了根系的生长［25］。在烟草和梨中过表达PbrWRKY53增强了对干旱胁迫的耐受性。与野生型相比，转基因植株的活性氧生成相对更少、抗氧化酶活性和代谢产物更高。此外，在转基因烟草中过量表达PbrWRKY53导致PbrNCED1的表达水平提高；敲除PbrWRKY53可下调PbrNCED1的表达丰度，同时降低其耐旱性［26］。水稻组ⅢWRKY 转录因子OsWRKY11 在干旱和高温胁迫时诱导表达，以热激蛋白HSP101基因作启动子驱动OsWRKY11表达时，转基因植株耐热性和耐旱性增强，叶片萎蔫变慢，离体叶片失水较慢；结果表明OsWRKY11基因在应对高温和干旱胁迫反应中起重要作用，可能有助于提高植物的抗逆性［27］。

为了解SbWRKY基因在干旱胁迫调控中所起作用，本研究利用公共数据库基因芯片表达谱数据，分析高粱组ⅢWRKY基因在干旱胁迫、热胁迫和复合胁迫条件下的表达模式，2 个基因（SbWRKY14和SbWRKY32）在3 种处理条件下均下调表达，1 个基因（SbWRKY41）在3 种处理条件下上调表达。基因的表达趋势通常反映其相应的功能，在雷蒙德棉中，干旱胁迫处理后，有16 个基因（其中包含3 个组Ⅲ成员）诱导表达，15 个基因表达量减少［28］；本研究通过qRTPCR 技术检测出12 个基因的表达谱，其中4 个基 因（SbWRKY10、SbWRKY53、SbWRKY75和SbWRKY93）在1 个或多个时间点诱导表达，而4个基因（SbWRKY16、SbWRKY38、SbWRKY41和SbWRKY42）在所有时间点均抑制表达。这些结果表明，不同的SbWRKY基因在应对干旱胁迫时可能起不同的调控作用。SbWRKY41的qRT-PCR检测结果与基因芯片检测的表达谱呈相反表达趋势，可能是由于两个研究采用的材料、干旱处理方法不同所致：本研究所用试材为BTx623，以20% PEG6000 模拟干旱胁迫；而芯片试验所用试材为R16，采用自然干旱胁迫处理［29］。

此外，WRKY 转录因子广泛参与了植物生长发育、各种生物及非生物胁迫进程，如在水稻中已验证了16 个OsWRKY 转录因子的功能，结果表现为Ⅰ类参与抗病进程，Ⅱb 类具有抗病和抗逆功能，Ⅱd 类调控植物的营养生长，而Ⅲ类具有调控营养生长和抗逆等功能［30］。本研究只开展了Ⅲ类基因在干旱胁迫条件下的表达谱分析，这些成员还可能响应低温、高温和高盐等胁迫反应并发挥一定作用。为深入了解这些基因的功能，后续还需克隆这些基因，通过转基因实验验证其生物学功能。

4 结论

高粱WRKY 转录因子基因在应对逆境胁迫中起重要调控作用，本研究在前人研究基础上挑选16 个高粱组ⅢWRKY 转录因子基因开展进一步研究。通过基因芯片分析结果表明，SbWRKY14和SbWRKY32在3 种处理条件下全部下调表达，表明这2 个WRKY基因在干旱胁迫、热胁迫和复合胁迫下具有相似功能；SbWRKY41在3 种胁迫条件下诱导表达。为进一步分析该组成员的表达谱，以20% PEG6000 模拟干旱胁迫，在0、1、3、6、12 h 取样，采用qRT-PCR 检测出该组12 个基因的表达谱；SbWRKY10、SbWRKY53、SbWRKY75和SbWRKY93在1 个或多个时间点诱导表达，而SbWRKY16、SbWRKY38、SbWRKY41和SbWRKY42在所有时间点均抑制表达。通过这两种分析方法，筛选到诱导和抑制表达基因，这为我们今后深入了解SbWRKY基因在干旱胁迫中的调控功能提供参考，也为我们克隆耐旱相关基因提供候选基因。