刈割茬次与制粒对紫花苜蓿维生素和化学成分的影响

孙 林 ，薛艳林，张福金，吴晓光，肖燕子，张欣昕，刘广华，刘思博

（1. 西华师范大学生命科学学院，四川 南充 637002；2. 内蒙古自治区农牧业科学院，内蒙古 呼和浩特 010031；3. 内蒙古自治区土地调查规划院，内蒙古 呼和浩特 010055；4. 呼伦贝尔学院农林学院，内蒙古 呼伦贝尔 021000）

紫花苜蓿(Medicago sativa)作为世界上栽培面积最大的牧草之一，因其高产量、消化率和适口性，各种营养成分齐全，尤其是粗蛋白质、维生素含量丰富，是我国北方主要豆科当家草种，也是反刍动物良好的蛋白质和天然维生素来源[1]，在改善生态环境、解决优质饲草短缺等方面起着重要作用[2]。在生长、加工过程中苜蓿品质除易受气候土壤条件、品种、浇水和施肥等环境因素影响外，刈割对其影响尤为显著[3]。有研究表明，苜蓿干物质(dry matter, DM)产量和营养价值指标受刈割茬次影响显著[4]。田雨佳[5]研究结果表明，在年刈割苜蓿3茬的地区，第3 茬苜蓿的中性洗涤纤维(neutral detergent fiber, NDF)和酸性洗涤纤维(acid detergent fiber, ADF)含量较低，粗蛋白质(crude protein, CP)含量较高，营养价值最高；第2 茬则相反，第1 茬居中。赵海明等[6]研究表明，海河平原区种植的紫花苜蓿粗蛋白质含量第2、3 茬显著高于第1、4 茬。第2、3 茬苜蓿生长时间较短，植株中叶片含量较高，枝条和叶片较为幼嫩，使得其具有较高的粗蛋白含量。陈水红等[7]对22 个紫花苜蓿品种的研究结果与之相似，随着刈割茬次的增加，粗蛋白质含量表现出先升高后降低的趋势。万素梅等[8]研究表明，第1 茬、第2 茬紫花苜蓿的粗蛋白质、灰分含量明显高于第3 茬，而纤维的含量则相反。Guo 等[9]研究表明，从营养品质、发酵品质和体外模拟瘤胃发酵参数指标来看，紫花苜蓿在同一个生育期收获调制青贮饲料，第1 茬苜蓿青贮优于第2 茬苜蓿。尉志霞等[10]研究表明，相比于日间刈割时间，刈割茬次对苜蓿青贮品质的影响更大。这些研究主要集中于不用刈割茬次对苜蓿干草和青贮品质影响方面，不同研究者针对不同地区种植的不同品种苜蓿的化学成分研究结果差异较大。因此，了解其不同茬次化学成分变化对于获得优质苜蓿草产品至关重要。

制粒是将粉状原料(牧草等)经挤压作用而成型的粒状饲料过程。有研究表明，牧草制粒后不仅保持了新鲜牧草的营养成分，同时兼具有消化率高、适口性好、耐贮存等优点，能很好地避免干草贮藏运输过程中带来的弊端[11]。同时，牧草经制粒时，因温度、水分和压力等综合作用，可以改善其中淀粉、蛋白质等成分分布情况，增强牧草中酶的活性，有效降低牧草中寄生虫卵和有害病原微生物的活性，牧草的消化率可提高10%～12%[12-13]，从而提高牧草的利用率。紫花苜蓿中富含多种维生素[14]。维生素是机体内少量需要的有机化合物，对代谢功能至关重要[15]。它们参与维持动物健康所需的许多代谢反应，有充当免疫刺激剂的作用。有研究表明，在动物的日粮中添加维生素B3、B5和Vc 均可以取得良好的饲喂效果[16-20]。然而，由于维生素微量和易破坏的结构特点，多数维生素不能稳定存在，遇到光、热、酸、碱时容易发生降解，制粒工艺中压力、温度和水分等外界因素可造成牧草20%～75%的维生素损失，具体损失程度取决于不同牧草对加工条件的敏感度[21]。纵观国内外相关文献，针对刈割茬次与制粒对苜蓿草颗粒维生素含量的研究资料鲜有报道。因此，本研究拟分析3 个茬次收获的紫花苜蓿草粉和草颗粒所含维生素和化学成分的变化规律，以进一步研究具有稳定保存草颗粒维生素作用的添加剂，减少畜禽外源维生素的添加，从而节约生产成本，为畜禽生产添砖加瓦；同时筛选出紫花苜蓿品质最佳的收获茬次，以期获得优质的苜蓿草颗粒。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试 验 于2016 年4 月1 日 − 2018 年12 月31 日，在内蒙古自治区农牧业科学院试验基地进行。该基地位于内蒙古自治区呼和浩特市清水河县，111°43′33″ E，39°45′15″ N，属于典型的半干旱大陆性气候。年均温7.4 ℃。年均降水量410 mm，年均日照时数2 900 h，无霜期136 d。

1.2 试验设计与材料

试验采用刈割茬次、制粒3 × 2 [茬次(C) × 制粒(Pel)]裂区试验设计。试验以种植第3 年的准格尔苜蓿为试验材料，刈割茬次为第1 茬、第2 茬和第3 茬，收获时间为现蕾期，留茬高度为5～6 cm。刈割后采取自然干燥方式调制干草。适时监测紫花苜蓿水分含量动态变化，当含水量降至12%～14%时，用电动粉碎机(FW 80 型，常州市国旺仪器制造有限公司)加工成长度为5 mm 苜蓿干草粉。此时取样待测草粉营养品质、维生素含量、大肠杆菌数量。然后，调节紫花苜蓿草粉含水量为22%～24%，将其混匀，直接经SKJ 250 型颗粒机(曲阜市启航机械有限公司生产，颗粒直径6 mm)制粒，冷却后取样，待测草颗粒的化学成分、维生素含量、大肠杆菌数量。每个处理设置3 个重复。

1.3 试验方法

1.3.1 维生素含量的测定方法

100 g 样品用真空冷冻干燥机(Free Zone 4.5 L，美国密苏里州堪萨斯城LABCONCO 公司)冷冻干燥2 d，冷冻干燥的样品粉碎后过1.0 mm 的筛，每份样品设置两个平行，采用高效液相色谱法测定维生素含量。维生素K1(VK1)、维生素C (Vc)、维生素B1(VB1)、维生素B2(VB2)、维生素B3(VB3)、维生素B5(VB5)和维生素B6(VB6)含量分别参照GB 5009.158–2016[22]、 GB 7303 –2018[23]、 GB/T 14700 –2018[24]、GB/T 14701–2019[25]、GB/T 17813–2018[26]、GB/T 18397–2014[27]和GB/T 14702–2018[28]方法测定。

1.3.2 营养品质指标的测定方法

试验样品于65 ℃鼓风干燥箱烘干，用微型植物粉碎机进行粉碎后过1 mm 筛，保存于密封袋中备用。将粉碎样品置于105 ℃烘箱中烘3 h，测定干物质(dry matter, DM)含量；粗灰分(crude ash，Ash)采用电炉碳化后，经马弗炉550 ℃灼烧3 h 后测定；有机物质计算公式:有机质(organic matter, OM) = 干物质 − 粗灰分；粗蛋白(crude protein, CP)采用半微量凯氏定氮法测定；粗脂肪(ether extract, EE)采用索氏抽提法测定；酸性洗涤纤维(acid detergent fiber,ADF)、中性洗涤纤维(neutral detergent fiber, NDF)采用Van Soets 法测定。以上指标均参照张丽英[29]的方法测定。

1.3.3 大肠杆菌数量的测定方法

取各处理样品10 g，装入盛有0.85%灭菌生理盐水90 m L 的三角瓶内，置于匀质机上拍打2 min，采用伊红美兰培养基[30]，分别接种10−1、10−2、10−33 个稀释梯度的悬浮液，将接种好的培养皿置于30 ℃恒温培养箱，培养24 h 后选取边缘整齐、圆形、表面有光泽呈灰白色的菌落进行大肠杆菌计数。

1.4 统计分析

运用Excel 2007 进行初步处理。采用SAS 9.0软件进行数据分析，利用Duncan 多重检验比较均值的差异显著性。因子数学模型：

式中：Yijk为观察值，μ 为均值，αi为茬次的影响(i =第1 茬、第2 茬、第3 茬)，βj为制粒的影响(j = 草粉、草颗粒)；αβij为茬次(C)和制粒(Pel)交互效应，即茬次(C) × 制粒(Pel)，εijk为误差。

2 结果与分析

2.1 刈割茬次与制粒对紫花苜蓿维生素含量的影响

刈割茬次对紫花苜蓿VK1含量无显著影响 (P =0.615 8) (表1)。制粒显著影响紫花苜蓿VK1含量(P ＜0.000 1)。草颗粒的VK1含量显著低于草粉。刈割茬次和制粒的互作效应对紫花苜蓿VK1含量无显著影响(P = 0.714 1)。

表 1 茬次与制粒对紫花苜蓿维生素K 1 和维生素C 含量的影响Table 1 Effect of cutting number and pelletizing on VK 1 and Vc content of alfalfa

刈割茬次(P = 0.000 2)和制粒(P = 0.013 8)对紫花苜蓿Vc 含量影响显著。第1 茬和第2 茬紫花苜蓿Vc 含量显著高于第3 茬，而草粉的Vc 含量(14.32 mg·kg−1)显著高于草颗粒(12.66 mg·kg−1)，高出13.11%。刈割茬次和制粒的互作效应对紫花苜蓿Vc 含量无显著影响(P = 0.531 4)。

刈割茬次(P ＜ 0.000 1)、制粒(P ＜ 0.000 1)和两因素互作效应(P = 0.007 6)对紫花苜蓿VB1含量影响显著(表2)。第1 茬紫花苜蓿VB1含量为4.04 mg·kg−1，显著高于第2 茬(3.63 mg·kg−1)和第3 茬(1.51 mg·kg−1)，分别高出11.29%和167.55%。草颗粒的VB1含量为3.63 mg·kg−1，显著高于草粉(2.49 mg·kg−1)，高出45.78%。刈割茬次(P ＜ 0.000 1)、制粒(P = 0.027 3)对紫花苜蓿VB2含量影响显著，第2 茬紫花苜蓿VB2含量为21.86 mg·kg−1，显著高于第1茬(16.50 mg·kg−1)和第3 茬(12.33 mg·kg−1)，分别高出32.48%和77.29%。草粉的VB2含量为18.08 mg·kg−1，显著高于草颗粒(15.72 mg·kg−1)，高出15.01%。两因素互作效应(P =0.302 0)对紫花苜蓿VB2含量无显著影响。刈割茬次对紫花苜蓿VB3含量影响显著(P ＜ 0.000 1)。第2 茬紫花苜蓿VB3含量为1.96 mg·kg−1，显著高于第1 茬(1.62 mg·kg−1)和第3 茬(0.33 mg·kg−1)，分别高出20.99%和493.94%。制粒(P = 0.097 3)和两因素互作效应(P = 0.813 1)对紫花苜蓿VB3含量无显著影响。刈割茬次对紫花苜蓿VB5含量影响显著(P =0.000 5)。第2 茬紫花苜蓿VB5含量为7.69 mg·kg−1，显著高于第1 茬(5.58 mg·kg−1)和第3 茬(6.83 mg·kg−1)，分别高出37.81%和12.59%。制粒(P = 0.079 0)和两因素互作效应(P = 0.187 5)对紫花苜蓿VB5含量无显著影响。刈割茬次(P = 0.000 7)、制粒(P = 0.000 2)和两因素互作效应(P = 0.002 0)对紫花苜蓿VB6含量影响显著。第3 茬紫花苜蓿VB6含量为0.64 mg·kg−1，显著低于第1 茬(0.88 mg·kg−1)和第2 茬(0.92 mg·kg−1)，分别低27.27%和30.43%。草粉的VB6含量为0.94 mg·kg−1，显著高于草粉(0.69 mg·kg−1)，高出36.23%。

表 2 茬次与制粒对紫花苜蓿B 族维生素含量的影响Table 2 Effect of cutting number and pelletizing on B group vitam in content of alfalfa

2.2 刈割茬次与制粒对紫花苜蓿营养品质影响

茬次对紫花苜蓿DM 含量影响显著(P = 0.018 2)，第2 茬和第3 茬紫花苜蓿的DM 含量显著高于第1 茬(表3)。制粒显著降低了紫花苜蓿DM 含量(P ＜0.000 1)；两因素的互作效应(P = 0.026 1)对紫花苜蓿DM 含量有显著影响。刈割茬次(P = 0.000 5)、制粒(P = 0.000 6)和两因素互作效应对紫花苜蓿OM含量影响显著(P = 0.000 4)。第1 茬紫花苜蓿的OM 含量为92.35%，显著高于第2 茬和第3 茬；草颗粒的OM 含量为91.75%，显著高于草粉(89.98%)。刈割茬次对紫花苜蓿CP 含量影响显著(P ＜ 0.000 1)，第2 茬紫花苜蓿CP 含量为17.40%，显著高于第1 茬和第3 茬；制粒(P = 0.238 5)和两因素互作效应(P = 0.132 2)对紫花苜蓿CP 含量无显著影响。刈割茬次对紫花苜蓿NDF 含量影响显著(P ＜ 0.014 1)，第2 茬紫花苜蓿NDF 含量为39.55%，显著低于第1 茬，但和第3 茬无显著差异；制粒(P = 0.062 5)和两因素互作效应(P = 0.069 5)对紫花苜蓿NDF 含量无显著影响。刈割茬次(P ＜ 0.000 1)和制粒(P =0.000 4)对紫花苜蓿ADF 含量影响显著，第2 茬紫花苜蓿ADF 含量为29.73%，显著低于第1 茬和第3 茬；草颗粒的ADF 含量为30.56%，显著低于草粉。两因素互作效应(P = 0.837 0)对紫花苜蓿ADF含量无显著影响。刈割茬次、制粒、和两因素的互作效应对紫花苜蓿EE 含量无显著影响。

表 3 茬次与制粒对紫花苜蓿营养品质的影响Table 3 Effect of cutting number and pelletizing on the nutritional content of alfalfa

2.3 刈割茬次与制粒对紫花苜蓿大肠杆菌数量影响

刈割茬次(P ＜ 0.000 1)、制粒(P ＜ 0.000 1)和两因素互作效应(P = 0.001 0)对紫花苜蓿大肠杆菌数量影响显著，第1 茬紫花苜蓿大肠杆菌数量显著低于第2 茬和第3 茬，而第2 茬紫花苜蓿大肠杆菌数量显著高于其他茬次(表4)。草颗粒附着的大肠杆菌数量显著低于草粉。第1 茬次紫花苜蓿草颗粒大肠杆菌数量最低为2.86 lg cfu·g−1。

表 4 茬次与制粒对紫花苜蓿大肠杆菌数量的影响Table 4 Effect of cutting num ber and pelletizing on Escherichia coli population of alfalfa sam p les

3 讨论

3.1 刈割茬次与制粒对紫花苜蓿维生素含量的影响

维生素的主要作用是作为酶的辅酶参与机体功能、调节机体代谢。紫花苜蓿制粒工艺的粉碎、混合、制粒、冷却等环节产生的温度、摩擦、压力等都会影响维生素的稳定性。VK 包括叶醌(VK1)、甲喹酮(VK2)和甲萘醌(VK3)等形式。VK 化合物都具有2-甲基-1,4-萘醌的生物活性[31]。本研究中刈割茬次对VK1含量无显著影响，但制粒后，苜蓿VK1含量显著降低，说明VK1受制粒工艺的影响显著。Vc 的化学性质极不稳定，遇碱或遇碱加热、遇光都能促进其氧化分解，失去生物活性[32]。Vc 作为植物营养成分的重要指标，易受气候、采收时期、加工方式、贮藏方式、时间等因素的影响[33-36]。有研究报道，蒸汽制粒可使日粮维生素C 损失20%～30%，挤压处理则有55%～70%被破坏[37]。严芳芳[38]研究发现制粒工艺中膨化浮性饲料中维生素C 晶体损失率达71%。沈祥[39]研究表明，饲料加工工艺中，制粒后Vc 纯品添加剂的保留率明显降低。本研究中第1 茬和第2 茬紫花苜蓿Vc 含量无显著差异，但显著高于第3 茬。紫花苜蓿草颗粒Vc 含量(12.66 mg·kg−1)显著低于草粉(14.32 mg·kg−1)，损失率达11.59%。因此，制粒工艺显著降低了紫花苜蓿VC 含量。B 族维生素作为一类低分子有机化合物(辅酶)。除了湿度和氧化还原反应单一条件能破坏维生素稳定性外，其他单一条件必须与其他因素结合才可能破坏维生素的稳定性[40]。Lew is 等[41]和 Lešková等[42]研究发现温度低于88 ℃时，制粒过程对B 族维生素含量无显著影响，进一步说明B 族维生素相对稳定，不易分解。Gadient 和Fenster[43]研究报道，无论在高温、室温还是低温环境下VB2稳定性都很好。高温35 ℃时，VB1和VB6的损失率略高，而VB5(泛酸)损失率明显升高。Zhuge 等[44]研究表明，随着温度的增高，VB2的损失程度明显比VB3的损失程度大。VB6在光照和碱性条件下不稳定，而VB3(烟酰胺)基本是稳定的，没有单一的条件能破坏它[45]。Hunt 和Bethke[46]研究表明苜蓿刈割后，在强光照射48 h 后，维生素B2含量减少了约25%。有研究表明制粒过程饲料维生素B1损失10%～20%，VB2损失约为15%[47]。综述所述，不同的研究得到的结果不同，可能是由于研究材料不同所致。本研究中，刈割茬次对B 族维生素含量影响显著。第2 茬紫花苜蓿VB2、VB3、VB5显著高于第1 和3 茬，第1 茬和第2 茬的VB6、Vc 含量无显著差异，但显著高于第3 茬，第1 茬的VB1含量显著高于第2 和3 茬。制粒对紫花苜蓿B3、B5无显著影响，进一步说明VB3对高温的稳定性。制粒工艺显著降低了VB2、VB6含量，说明VB2、VB6遇高温分解。而制粒后显著提高了VB1含量，该结果有待进一步研究。

3.2 刈割茬次与制粒对紫花苜蓿大肠杆菌数量和化学成分的影响

刈割是紫花苜蓿的主要利用方式，刈割茬次影响紫花苜蓿营养价值。营养物质含量是衡量牧草品质优劣的基本指标，其中较为重要的是CP 含量和纤维物质。CP 含量的多少是饲料饲用价值的主要反映。研究表明，不同的刈割茬次对苜蓿的CP 含量也有很重要的影响，刈割次数的增加会降低植株的再生能力同时降低饲草营养品质[48]。ADF 和NDF的含量关系到动物对所食牧草的采食与消化情况，ADF 和NDF 含量越低牧草营养价值越高。李菲菲[3]研究表明，刈割茬次对紫花苜蓿DM、ADF、NDF、CP、Ash 含量影响显著，但对EE 含量影响不显著，茬次对苜蓿干草DM 含量有极显著影响，茬次的递增会增加DM 的积累，第3 茬DM 含量总体显著高于第1 茬和第2 茬。本研究中，除刈割茬次除对EE无显著影响外，对其他营养成分指标影响显著，该结果与李菲菲[3]研究结果一致。本研究中，第2 茬紫花苜蓿CP 含量高于第1 茬和第3 茬，这是由于紫花苜蓿的蛋白主要集聚于叶中，第2 茬紫花苜蓿生长正处于雨热同期，生长旺盛，叶片数量多，保持幼嫩，且损失少，进而增加CP 含量，降低了NDF、ADF含量。第2 和3 茬DM 含量高于第1 茬，这是由于第1 茬紫花苜蓿返青后灌水量大，水分充足，植株水分含量高，DM 含量较低，第2 茬和第3 茬紫花苜蓿试验地未进行灌溉，生长期间温度升高、气候干燥且降雨量偏低，导致DM 积累较多。第1 茬紫花苜蓿OM 含量高于第2 和3 茬，可能是由于第2 茬和第3 茬紫花苜蓿生长过程的外界环境有助于粗灰分的富集。Sanderson 和Wedin[49]报道无论是气温较低的条件下还是气温较高的环境，紫花苜蓿中NDF 含量在第1 茬刈割前期积累最多。本研究中第1 茬紫花苜蓿NDF含量平均为41.80%，高于第2 茬和第3 茬。该结果与上述结果一致。杜书增等[50]为评价刈割茬次对紫花苜蓿产量及营养价值的影响，在陕西省旬邑县种植了3 个品种紫花苜蓿，结果表明：第1 茬的营养价值优于第2 茬和第3 茬。宋书红等[51]研究表明，不同刈割茬次紫花苜蓿营养品质的高低顺序为第1 茬 ＞ 第2 茬 ＞ 第3 茬。本研究表明，第2茬紫花苜蓿品质优于第1 茬和第3 茬，第3 茬刈割的紫花苜蓿干草品质较低，这是由于潮湿的天气推迟了收获时间，该结果与上述结果不一致，可能是由于不同品种、气候、施肥、刈割时间、收获期、管理等客观因素造成的，有待于进一步研究。

孙林[52]研究报道针茅草原牧草经加工成草颗粒后，针茅(Stipa)草颗粒干物质、粗蛋白质与针茅干草草粉无显著差异。本研究中，制粒对CP、NDF、EE 无显著影响，但草粉的DM 含量高于草颗粒，这主要是由于制粒时为了达到适宜的含水量添加了一定比例的水所致。草颗粒的OM 含量显著高于草粉，这可能是由于制粒时使部分矿物质元素受损而降低；而ADF 含量显著低于草粉，主要是由于制粒使紫花苜蓿纤维素结构形式改变[47]。

朝鲁孟其其格等[53]报道草颗粒形成过程经蒸汽高温能杀灭寄生虫卵和其他病原微生物。调制过程中的高温、高湿和压力的处理可使饲料中有害微生物失活。Ekperigin 等[54]报道经制粒处理，大肠杆菌、非乳酸发酵菌全部灭活，好氧生物和真菌分别灭活99.7%和93.6%。本研究中，紫花苜蓿制粒后大肠杆菌数量显著降低，进一步验证了制粒工艺是影响大肠杆菌数量的主要因子；3 个茬次紫花苜蓿大肠杆菌由低到高的顺序为第1 茬 ＜ 第3 茬 ＜ 第2 茬。茬次与制粒两因素的互作效应显著，第1 茬草颗粒大肠杆菌数量最低。

4 结论

综合分析，第1 茬和第2 茬紫花苜蓿具有较高维生素含量，且第2 茬紫花苜蓿营养品质优于第1 茬和第3 茬。制粒显著降低了紫花苜蓿VB2、VB6、Vc、VK1含量，且抑制了其表面附着大肠杆菌的活性。