白藜芦醇抑制人肝微粒体代谢色氨酸的研究

吴栋丽，汪 静，陈 爽，钟诗龙

(1.南方医科大学药学院，广东 广州 510515； 2.广东省人民医院药学部，广东 广州 510080；3.广东省人民医院广东省医学科学院，广东省心血管病研究所，广东省冠心病防治研究重点实验室；广东 广州 510080)

白藜芦醇是天然多酚类植物抗毒素，在虎杖、葡萄、花生、桑葚等植物中广泛分布。白藜芦醇以其抗氧化的特性而广为人知，例如清除多种活性氧(reactive oxygen species，ROS)、自由基、活性氮，增强过氧化氢酶等抗氧化防御酶的表达，在维持细胞氧化还原平衡中具有重要意义[1-2]。此外，白藜芦醇还具有抗肿瘤、抗炎、增强内皮细胞一氧化氮合成、抑制血管平滑肌细胞增殖和血小板聚集等多种生理活性[3-4]。

色氨酸(tryptophan，TRP)是人体必需氨基酸，机体主要有3条代谢途径，分别是5-羟色胺途径，犬尿氨酸途径及经肠道菌群代谢的吲哚途径[5]。约95%的色氨酸经过犬尿氨酸途径代谢，主要代谢产物有犬尿氨酸(kynurenine，KYN)、犬尿喹啉酸(kynurenic acid， KYNA)、3-羟基邻氨基苯甲酸(3-hydroxyanthranilic，3-HAA)；该途径可以调控机体循环系统中的色氨酸水平。吲哚胺2,3-双加氧酶(indoleamine 2,3-dioxygenase，IDO)是犬尿氨酸途径的关键酶。犬尿氨酸途径代谢失衡与心血管疾病、免疫抑制、神经系统活动等紧密相关[6-7]。血浆中的犬尿氨酸被认为是为慢性心力衰竭的生物标志物[8]。KYN/TRP比值水平反映IDO的活性。KYN/TRP比值是冠状动脉疾病患者发生主要不良冠状动脉事件和全因死亡的预测因子[7]。犬尿氨酸途径也是先天性和适应性免疫的关键调节因子，其下游代谢物如犬尿氨酸、3-羟基犬尿氨酸(3-hydroxykynurenine，3-HK)、喹啉酸(quinolinic acid，QA)和吡啶甲酸(picolinic acid，PA)都被证实具有免疫抑制作用[9]。KYNA和QA被认为是N-甲基天冬氨酸受体的拮抗剂和激动剂，二者之间的平衡决定了神经元的兴奋性状态；常与精神分裂症和抑郁有关[10]。

白藜芦醇可以上调黑色素瘤细胞中间隙连接蛋白-43(connexin 43，Cx43)的表达，并且能抑制IDO蛋白的表达[11]。此外，白藜芦醇能够抑制干扰素-γ(interferon-γ，IFN-γ)诱导的骨髓树突状细胞(bone marrow-derived dendritic cells，BMDCs)中IDO的表达和活性[12]。由此可见，白藜芦醇发挥抗肿瘤作用可能与抑制IDO有关。而目前暂无白藜芦醇是否影响犬尿氨酸途径代谢相关研究的报道，关于肝微粒体代谢色氨酸的研究也很少。因此，本研究基于体外人肝微粒体孵育色氨酸代谢体系，探讨白藜芦醇对犬尿氨酸途径代谢的影响；为进一步研究白藜芦醇的药理作用机制及色氨酸代谢提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 仪器LC-20A高效液相色谱仪(Shimadzu)，配有电喷雾电离(ESI)源的API 4000 QTrap三重四极杆质谱仪(AB Sciex)；Milli-Q纯化系统(EMD Millipore,Billerica)；DSHZ-300A 水浴锅(江苏太仓市实验设备厂)；Toledo XA205 分析天平(梅特勒公司)；Allegra X-30R 台式高速冷冻离心机(Beckman Coutler)；Vortex-5 涡旋振荡器(其林贝尔 Kylin-bell)。

1.2 药物与试剂色氨酸(TRP，99%，J&K Scientific，批号：LAB0R08)；犬尿氨酸(KYN，>98%，阿拉丁，批号：C1907148)；色氨酸-d5和犬尿氨酸-d4(TRP-d5，98%；KYN-d4，98%；Toronto Research Chemicals，批号分别为：2-LXM-187-1；4-MOZ-161-3)；Epacadostat(Epa，98%，萨恩化学技术上海有限公司(安耐吉化学)，批号：GA250269)；活性炭(100目粒度，Sigma-Aldrich，批号：MKBQ5057V)；白藜芦醇(Res，>99%，梯希爱上海化成工业发展有限公司，批号：ZFBCC-RA)；HPLC级乙腈和甲醇(Thermo Fisher Scientific，批号分别为：JA067630；WXBC9577V)；HPLC级甲酸(Sigma-Aldrich，批号：77Y1211RS)；混合人肝微粒体(HLM,蛋白质量浓度为20 g·L-1，瑞德肝脏疾病研究上海有限公司，批号：VIN)；烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH，95%，上海易恩化学技术有限公司，批号：RH108167)；磷酸氢二钾，磷酸二氢钾，氯化镁(K2HPO4，99%；KH2PO4，99.5%；MgCI2，99%；上海麦克林生化科技有限公司，批号分别为：C10084223，C10091971，M21918024)；黄素腺嘌呤二核甘酸(FAD，Sigma-Aldrich，批号：SLBS5158)。

1.3 LC-MS/MS分析方法应用AB Sciex API4000 QTrap三重四极杆质谱仪，电喷雾电离(ESI)，正离子源，在多反应检测(MRM)模式下扫描。基本的质谱参数：电喷雾电压(IS)为5 500 V；气帘气压力(CUR)25 psi；雾化气压力(GS1)50 psi；辅助气压力(GS2)50 psi；离子源温度(TEM)550 ℃。MRM模式监测反应质荷比(m/z)：205.1→146.1(TRP)，210.3→192.2(TRP-d5)，209.1→94.1(KYN)，181.3→164.0(KYN-d4)，具体质谱参数如Tab 1所示。

岛津LC-20A高效液相色谱仪，色谱柱：XSelect HSS T3 3.5 μm(2.1 mm×100 mm)；流速：0.3 mL·min-1；进样量：3 μL；柱温：30 ℃；分析时间共5 min；流动相：0.01%甲酸水(A)-乙腈(B)，采用梯度洗脱方式：0-0.1 min 5% B，0.1-0.5 min 5%-60% B，0.5-2.8 min 60% B，2.8-2.9 min 60%-5% B，2.9-5.0 min 5% B。

Tab 1 Collection ion pair,mass spectrometry parameters and retention time of tryptophan and kynurenine

1.4 溶液制备精密称取色氨酸和犬尿氨酸适量，溶于甲醇，得到标准品储备液：色氨酸2 g·L-1，犬尿氨酸1 g·L-1。采用上述标准品储备液制备8个梯度浓度的混合标准品工作液(色氨酸：200-40 000 μg·L-1，犬尿氨酸：3.75-750 μg·L-1)。质量控制的样本分别为色氨酸：400、4 000、20 000 μg·L-1，犬尿氨酸：7.5、75、375 μg·L-1。精密称取适量的TRP-d5和KYN-d4，于甲醇中完全溶解，制成质量浓度均为1 g·L-1的储备液；分别稀释至1 000 μg·L-1，500 μg·L-1为混合内标工作液。所有标准溶液于80 ℃保存备用。

称取K2HPO4：1.42 g和KH2PO4：0.27 g均完全溶解于超纯水，调节pH至7.4即为磷酸盐缓冲液(KPI)，于4 ℃保存。精密称取MgCI2、NADPH、FAD，用超纯水溶解，分别配置成浓度为：60、40、1 mmol·L-1的溶液；Epacadostat(阳性药物)和白藜芦醇，采用甲醇：DMSO(V ∶V=10 ∶1)溶解，制成浓度为4 mmol·L-1的储备液；上述溶液均于20 ℃保存备用。

1.5 体外肝微粒体孵育色氨酸代谢人肝微粒体孵育色氨酸代谢体系总体积120 μL，包括KPI(pH 7.4)、MgCI2、人肝微粒体、NADPH、FAD、色氨酸，如Tab 2所示。将上述试剂加入反应管中，37 ℃孵育90 min，孵育结束后转移至冰上，加入预冷的乙腈360 μL及40 μL混合内标工作液终止反应，充分震荡涡旋4 min，20 ℃静置10 min，12 000 r·min-1于4 ℃离心20 min，取上清液进行LC-MS/MS分析。

1.6 色氨酸在人肝微粒体中的酶动力

1.6.1最佳孵育时间优化 将Tab 2中体系各个成分加入反应管中，反应时间分别为：0、30、60、90、120、180、270、360 min，各时间点平行3份。每个时间点同时做一组不加色氨酸的对照组A(孵育体系中不包括色氨酸)，孵育结束后转移至冰上，之后同1.5项下操作。绘制时间-犬尿氨酸曲线(犬尿氨酸的生成量为实验组扣除每个时间点的对照组A)，选取最佳色氨酸孵育时间。

Tab 2 The metabolism system of tryptophan

1.6.2最佳肝微粒体蛋白浓度优化 将色氨酸标准品工作液加入人肝微粒体孵育色氨酸代谢体系中，其肝微粒体蛋白浓度分别为0、0.167、0.25、0.50、1.00、1.33、2.00、4.00 g·L-1，各个肝微粒体蛋白浓度平行3份，孵育时间为90 min(优化后的最佳时间)。针对每个肝微粒体蛋白浓度同时做一组不加色氨酸的对照组A，孵育结束后转移至冰上，之后同1.5项下操作。绘制微粒体蛋白浓度-犬尿氨酸曲线(犬尿氨酸的生成量为实验组扣除每个肝微粒体蛋白浓度的对照组A)，选取最佳肝微粒体蛋白浓度。

1.6.3色氨酸在体外人肝微粒体中的酶动力参数 取不同浓度的色氨酸标准品工作液，加入肝微粒体蛋白浓度为1 g·L-1(经过优化的肝微粒体蛋白浓度)的孵育体系中，使得色氨酸的最终浓度分别为：0、2、4、6、8、10、16、20、40 mg·L-1，孵育90 min，各个色氨酸浓度平行3份。同时做一组不加色氨酸的对照组A，孵育结束后转移至冰上，之后同1.5项下操作。绘制色氨酸浓度-犬尿氨酸酶动力学曲线(犬尿氨酸的生成量为实验组扣除每个色氨酸浓度的对照组A)，计算酶动力学参数。

1.7 白藜芦醇对人肝微粒体代谢色氨酸的影响将低、中、高3个浓度的Epacadostat(阳性对照组)和白藜芦醇标准品(实验组)工作液，分别加入上述已优化的人肝微粒体孵育色氨酸代谢体系中，使得药物的终浓度为：2.5、20、50 μmol·L-1，各个浓度平行3份。同时孵育对照组B(人肝微粒体孵育色氨酸体系)和对照组C(药物溶剂组)。孵育结束后转移至冰上，之后同1.5项下操作，分析犬尿氨酸生成量的变化。

1.8 数据处理实验所得数据采用SPSS 20.0(IBM Corporation，NY，USA)软件进行分析，采用ANOVA方法分析各组间差异。根据人肝微粒体的蛋白浓度和酶促反应时间计算酶促反应代谢物的生成速率；利用GraphPad Prism 7.04软件，采用米氏方程V=(Vmax×S)/(Km+S)进行非线性拟合，得到色氨酸在人肝微粒体的动力学参数Vmax和Km。

2 结果

2.1 LC-MS/MS方法学

2.1.1方法专属性和线性 结果显示色氨酸、犬尿氨酸的保留时间分别为1.10、1.09 min，峰型良好(Fig 1)。在活性炭吸附已灭活的微粒体孵育体系中加入8个不同梯度浓度的混合标准品工作液，按照上述1.5项的处理方法，进样分析得到峰面积。用最小二乘法进行相关与回归分析，待分析物的浓度为X轴，峰面积与内标的比值为Y轴。结果表明色氨酸(200-40 000 μg·L-1)，犬尿氨酸(3.75-750 μg·L-1)线性关系良好(r≥0.99)。

2.1.2精密度和准确度 连续3 d检测最低定量限、低、中、高不同浓度的质控样本。结果显示色氨酸和犬尿氨酸日内精密度的RSD分别为：3.26%-6.29%，3.58%-14.52%；日间精密度的RSD分别在6.40%-16.73%，4.44%-18.04%之间。肝微粒体孵育体系中色氨酸和犬尿氨酸精密度的RSD均在15%以内，最低定量下限的精密度的RSD在20%范围内。最低定量限、低、中、高不同浓度的色氨酸和犬尿氨酸准确度的RE均在15%以内。均符合生物样本检测要求(Tab 3)。

2.1.3基质效应、回收率和稳定性 该分析方法中测定肝微粒体孵育体系中色氨酸和犬尿氨酸的基质效应分别在(87.34±5.52)%-(93.91±2.61)%，(86.30±3.27)%-(92.30±3.85)%之间，均在15%以内；因此样品制备分析方法对待测物质是有效的(Tab 3)。色氨酸和犬尿氨酸的回收率在(64.83±5.03)%-(80.21±3.67)%之间，RSD均小于15%(Tab 3)。考察肝微粒体孵育体系中低、高两个浓度的色氨酸和犬尿氨酸质控样品在室温、进样器放置4 h，24 h反复冻融3次，以及80 ℃放置15和30 d的稳定性。结果显示肝微粒体孵育体系中色氨酸和犬尿氨酸在不同条件下测得浓度偏差均在15%以内，说明样本在检测过程中稳定性良好(Tab 4)。

Fig 1 Chromatograms of tryptophan and kynurenine

Tab 3 Precision,accuracy,recovery and matrix effect for quantification of tryptophan and kynurenine

Tab 4 Stability of tryptophan and kynurenine in liver microsome incubation system

Fig 2 Effect of tryptophan incubation time and microsomal protein concentration on formation of kynurenine by human liver microsomes and enzyme kinetic parameters

Fig 3 Resveratrol and epacadosta inhibited human liver microsomal tryptophan metabolism to kynurenine

2.2 色氨酸体外代谢孵育最佳时间色氨酸与人肝微粒体在37 ℃孵育不同时间(0-360)min，考察代谢物犬尿氨酸的生成量和孵育时间的关系。结果如Fig 2A所示，在0-120 min内犬尿氨酸的生成量随时间呈增长趋势。120 min后犬尿氨酸的生成量逐渐趋于缓和。因此，最终选择90 min为最佳孵育时间。

2.3 色氨酸体外代谢孵育的最佳肝微粒体蛋白浓度人肝微粒体孵育色氨酸代谢体系中肝微粒体蛋白终浓度在0-4 g·L-1范围内，考察代谢物犬尿氨酸的生成量和肝微粒体蛋白浓度的关系。如Fig 2B所示，犬尿氨酸的生成量与肝微粒体蛋白浓度在(0-1.33) g·L-1范围内呈线性关系，随后犬尿氨酸生成量逐渐趋于缓和。因此，蛋白浓度在(0-1.33) g·L-1范围内犬尿氨酸的生成速率最快，选择该范围内的肝微粒体蛋白浓度为最佳浓度。

2.4 色氨酸在肝微粒体中的酶动力学参数色氨酸在体外人肝微粒体中代谢生成犬尿氨酸，酶反应速率常数Km为(95.91±22.29) μmol·L-1，最大反应速率Vmax为(21.34±2.58) μmol·g-1·min-1；酶动力学曲线如Fig 2C所示。

2.5 白藜芦醇以浓度依赖性抑制IDO活性在体外人肝微粒体孵育色氨酸代谢体系分别加入低、中、高不同浓度的白藜芦醇和Epacadostat。Epacadostat是已报道的IDO抑制剂，在本次研究做作为阳性药物达到阳性对照目的；加入肝微粒体孵育色氨酸代谢体系中发现犬尿氨酸生成减少，并且具有浓度依赖性(Fig 3A)。肝微粒体孵育色氨酸代谢体系中加入白藜芦醇也能够抑制犬尿氨酸的生成；并且随着白藜芦醇浓度增加，犬尿氨酸的生产量随之减少；20 μmol·L-1和50 μmol·L-1与对照组B和C比较均具有统计学差异(Fig 3B)。这表明白藜芦醇能够以浓度依赖性抑制IDO的活性，减少犬尿氨酸的生成。

3 讨论

本研究创建体外人肝微粒体孵育色氨酸代谢体系及采用LC-MS/MS方法检测肝微粒体孵育体系中色氨酸和犬尿氨酸。结果显示白藜芦醇通过抑制IDO的活性减少犬尿氨酸的生成，其抑制能力的强弱呈现浓度依赖性。利用LC-MS/MS方法检测肝微粒体孵育体系中的色氨酸和犬尿氨酸水平，具有专属性强、灵敏度高、精密度好、样本分析过程中待测物质稳定、样本处理简单等优点。

色氨酸是内源性的化合物，肝微粒体孵育体系中可以检测到色氨酸和犬尿氨酸。因此，实验过程中我们同时做一组不加色氨酸的对照组A，消除体系本身代谢产物的变化。采用活性炭吸附已灭活的肝微粒体孵育体系配置标准曲线，可以消除微粒体中色氨酸和犬尿氨酸的干扰。色氨酸分解代谢生成犬尿氨酸这一途径的关键酶是IDO，IDO是含亚铁血红素的双加氧酶。在肝微粒体孵育色氨酸代谢体系建立的过程中也加入过亚铁血红素，但是没有发现犬尿氨酸生产量随之增加。已有的IDO活性检测体系中含有抗坏血酸[13]，在我们建立的肝微粒体孵育色氨酸代谢体系中也加入抗坏血酸，但是未发现犬尿氨酸的生成量增加。因此，在我们的人肝微粒体孵育色氨酸代谢体系中未加入抗坏血酸和亚铁血红素。本研究的LC-MS/MS检测方法选用同位素标记的色氨酸和犬尿氨酸作为内标，其与待检测物质有着相同的化学结构和化学性质，在一定程度上能够降低分析过程中其他干扰物质的影响，提高定量方法的准确度。

正常生理条件下IDO表达水平较低，炎症等疾病情况下IDO能够被一些炎症因子激活，如IFN-γ、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白介素-6(interleukin-6，IL-6)[14]。这些炎症因子水平与IDO密切关联。白藜芦醇作为免疫调节剂的作用在各种动物模型和不同细胞系中都得到证实[15]。在啮齿类动物中，白藜芦醇可以减轻腹膜炎的炎症反应，提高机体对癌细胞的免疫活性。在免疫系统中，白藜芦醇可以激活沉默调控蛋白-1(sirtuin-1)抗炎途径，降低核转录因子-κB(nuclear transcription factor-κB，NF-κB)诱导的炎症因子水平(如TNF-α、IL-6、IL-1β)、环氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)。IFN-γ诱导BMDCs中IDO蛋白的表达，经白藜芦醇干预后IDO表达量减少；白藜芦醇治疗的小鼠肿瘤生长受到抑制，肿瘤细胞中IDO表达量也降低[12]。另外，抑郁小鼠大脑皮层中IDO和TNF-α水平均上调，而给予白藜芦醇灌胃处理后抑郁小鼠脑组织中IDO、IL-6、TNF-α的mRNA水平及蛋白表达量均显著降低[16]。上述研究结果表明白藜芦醇能够抑制机体炎症因子的生成，并减少体内IDO蛋白的表达。本研究进一步发现白藜芦醇能够抑制人肝微粒体中色氨酸代谢生成犬尿氨酸，这表明IDO很可能是白藜芦醇发挥药理作用的关键靶标。

色氨酸及其犬尿氨酸途径的分解代谢物参与形成免疫抑制环境。IDO活性增加能够激活犬尿氨酸途径，使得犬尿氨酸的水平增加并加速色氨酸的消耗。犬尿氨酸生成增加可以激活芳香烃受体(Aryl hydrocarbon receptor，AHR)，抑制T细胞增殖。局部色氨酸耗竭能够激活一般性调控阻遏蛋白激酶2(general control nonderepressible 2，GCN2)和抑制雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)，从而诱导Tregs分化、抑制T细胞增殖，致使T细胞免疫功能下降[9]。犬尿氨酸途径的代谢物如3-HAA和QA同样被证实可直接诱导辅助性T细胞1(help T cell 1，Th1)凋亡，而对辅助性T细胞2(help T cell 2，Th2)无影响，导致Th1/Th2失衡，促使肿瘤的发展[17]。IDO的小分子抑制剂1-甲基色氨酸(1-methyl-tryptophan，1-MT)能够抑制高表达IDO的肿瘤的生长[17]。因此，IDO主要通过调节色氨酸代谢来介导肿瘤免疫逃逸。Noh等[12]研究表明，白藜芦醇通过激活JAK/STAT1和PKCδ途径调节IDO的免疫应答过程。基于上述表明IDO介导的犬尿氨酸途径在免疫抑制中具有重要作用；本研究发现白藜芦醇抑制人肝微粒体代谢生成犬尿氨酸，这提示白藜芦醇在免疫抑制方面可能具有潜在作用，为白藜芦醇应用于药物研发提供重要依据。

另一方面，IDO被激活引起犬尿氨酸途径代谢增加与心血管疾病密切相关。犬尿氨酸可以诱导NADPH氧化酶产生ROS，在体内外加速内皮细胞的凋亡[7]。KYNA能以剂量依赖的方式降低心脏线粒体的呼吸参数，可能参与心肌病的进程[18]。高脂饲料喂养小鼠后平滑肌细胞中IDO活性增加；而IDO缺乏可以抑制高脂饲料喂养的LDLR-/-小鼠动脉粥样硬化形成[7]。本研究发现白藜芦醇可以抑制IDO活性，减少犬尿氨酸的生成，这提示白藜芦醇可能通过作用于IDO而发挥心血管保护作用。

总之，色氨酸及其犬尿氨酸途径代谢产物在免疫、心血管疾病等方面具有重要作用。基于人肝微粒体孵育色氨酸代谢体系研究结果表明白藜芦醇能够抑制IDO活性，使色氨酸向犬尿氨酸途径代谢减少，并且呈浓度依赖性。抑制IDO活性、调节色氨酸代谢可能是白藜芦醇发挥多种药理活性的机制之一。因此，白藜芦醇作为潜在IDO抑制剂应用与药物开发研究具有重要意义。