王丹丹,孙大林,金保方
(1.东南大学医学院,南京 210009; 2.东南大学附属中大医院中西医结合男科,南京 210009)
低分子肝素(low molecular weight heparin,LMWH)是由普通肝素经酶或化学解聚而得到的平均分子量为4 000~5 000的片段,因其与蛋白质及细胞的结合减少,故具有生物利用度高、抗凝作用持续时间较长、无须实验室频繁监测、肝素诱导的血小板减少症风险及骨质疏松发生率较低等优点[1-3]。近年来,LMWH被广泛用于防治心脑血管疾病、肝肾疾病、下肢深静脉血栓、肺栓塞及肿瘤等;同时,因其皮下给药便于门诊治疗且不通过胎盘,亦不分泌于乳汁中,故目前逐渐成为生殖医学领域防治不良妊娠结局(adverse pregnancy outcome,APO)的常用药物[4-6]。然而,APO的产生,大多与胚胎染色体异常、自身免疫因素及血栓前状态(prethrombotic state,PTS)有关,而LMWH兼具有调节免疫与抗凝的作用;此外,LMWH亦可作用于滋养细胞,具体表现为促进细胞增殖与迁移,但此效用并非剂量依赖性[7]。既往研究多集中于LMWH对妊娠中晚期APO(包括子痫前期、妊娠期肝内胆汁淤积症、羊水过少及胎儿宫内生长受限等)的改善,而对早期APO的报道较少。现就LMWH应用于早期APO的研究进展予以综述,以期为临床治疗提供参考。
1.1抗凝、抗血栓 LMWH的主要生物学作用是调节凝血系统[8]。LMWH通过其独特的戊糖序列与丝氨酸蛋白酶抑制剂抗凝血酶Ⅲ(antithrombin Ⅲ,AT-Ⅲ)结合,继而使AT-Ⅲ发生构象改变,导致AT-Ⅲ由凝血因子Ⅱa(又称凝血酶)和凝血因子Ⅹa的慢速灭活剂变为快速灭活剂,最终增强AT-Ⅲ的抗凝活性[9]。然而,凝血酶失活需要分子链长度至少为18个糖单位的肝素、AT-Ⅲ和凝血酶形成三元复合物,而LMWH分子链很少能达到以上长度,故对凝血酶的活性降低,即抗凝血因子Ⅹa/抗凝血因子Ⅱa比值约为4;由于减少了对凝血因子Ⅱa的抑制作用,LMWH在保持抗凝作用的同时降低了出血风险[10]。此外,LMWH亦可促进纤溶酶原向纤溶酶转化,阻断纤维蛋白原转变成纤维蛋白,进而起到抗血栓的作用,并降低血小板减少症的发生风险[2]。
1.2抗炎 20世纪60年代,有学者提出了肝素可能具有抗炎作用,随后一系列研究[10-12]证实了这一观点。Poterucha等[10]认为,炎症参与血栓形成,主要通过破坏内皮细胞功能、局部招募白细胞和促进促凝环境实现,且肝素作为炎症的调节剂有其特定生物学基础,可能通过多个水平发挥抗炎作用,具体表现为:①抑制中性粒细胞活化;②与血管内皮细胞相互作用,进而阻止激活固有免疫系统的炎症介质(核因子κB、肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-6、白细胞介素-8和白细胞介素-1β)表达;③抑制血管平滑肌细胞增殖;④通过抗凝作用抑制炎症。值得注意的是,LMWH抗炎的作用并不弱于普通肝素。此外,有学者提出LMWH亦可能通过免疫途径抑制炎症,如Sheikhansari等[12]推测,LMWH可能通过结合选择素、整合素后阻止白细胞黏附、抑制补体活化,进而发挥抗炎作用。
1.3免疫调节 LMWH主要通过免疫细胞及细胞因子发挥免疫调节作用。如Hao等[8]提出,肝素通常储存于肥大细胞颗粒中,而肥大细胞脱颗粒与血管通透性增加引起变态反应有关。此外,有文献报道,LMWH可以抑制抗磷脂抗体产生的免疫反应,促进滋养细胞的增殖、侵袭及分化,抑制滋养细胞凋亡,保护血管内皮,促进胎盘形成[13]。另有研究报道,LMWH及乙二醇分裂肝素衍生物(一种改良型非抗凝剂LMWH)均可与可溶性fms样酪氨酸激酶受体1相互作用,促进胎盘绒毛组织释放胎盘生长因子,增强胎盘条件培养基中内皮细胞的形成,并通过抑制补体激活、白细胞与活化内皮细胞的黏附来抑制炎症反应[14]。可见,LMWH具有非抗凝作用,但仍需进一步研究。
1.4抗肿瘤 LMWH可以通过与多种介质(如生长因子、黏附分子和酶)相互作用来干扰肿瘤的生物学过程,其具体机制可能为:①抑制血管生成;②抑制淋巴管生成;③抗转移(包括抑制肿瘤细胞对内皮细胞的黏附、抑制肿瘤细胞-血小板-中性粒细胞复合物的形成、促进自然杀伤细胞清除肿瘤细胞);④调节CXC趋化因子配体12、CXC趋化因子受体4和组织因子途径抑制物来促进肿瘤细胞凋亡;⑤增加抑癌基因、减少原癌基因,从而直接调节肿瘤细胞功能[15]。此外,有学者推测,LMWH可能通过与P选择素的相互作用进而减少肿瘤的转移[8]。总之,LMWH抗肿瘤的作用机制较为复杂,目前尚不完全清楚,需进一步深入研究。
1.5降脂 此外,LMWH还具有降血脂的作用。李良玉等[16]通过构建高脂血症小鼠模型并喂养不同剂量的肝素类物质,观察到高剂量LMWH可降低小鼠三酰甘油水平,且LMWH的降血脂能力优于普通肝素;并进一步提出,LMWH可能通过其戊糖结构与胆固醇、胆酸形成复合物,继而抑制脂肪吸收、促进脂肪降解及排泄来降低血脂。陈杰等[17]通过临床对照研究发现,加用LMWH治疗2周可有效降低妊娠中期血脂异常孕妇的三酰甘油、总胆固醇及低密度脂蛋白水平,进而降低妊娠期糖尿病及高血压的发病风险。
1.6其他 除上述作用外,有文献报道,LMWH还具有抗病毒及抑制氧化应激的作用[8,18]。Bal Dit Sollier等[19]发现,LMWH之所以具有以上特殊药理作用的原因为:其能够与内皮细胞上的糖萼发生交换。此外,有研究显示,对LMWH的结构进行修饰可以构建出多种衍生物,进而更有针对性地应用于临床[15]。可见,LMWH仍具有很大的临床应用潜力,值得学者们深入挖掘与研究。
APO是指与妊娠、分娩相关并发症对母体和胎儿近期或远期的影响[20]。APO是一泛指名词,对母体近期的影响主要为子痫前期、妊娠期糖尿病、妊娠期肝内胆汁淤积症、产后出血等;而对胎儿的影响主要为流产、死胎、胎儿宫内生长受限、胎儿畸形、新生儿窒息等;以及对母体远期心血管疾病的影响[20-21]。其中,APO根据妊娠时长又可分为早期(妊娠12周内)和中晚期。既往文献报道多集中在与APO发生相关的影响因素上[22],而关于LMWH对其防治方面的研究较少。以下主要介绍LMWH在改善早期APO方面的应用,包括反复种植失败(recurrent implantation failure,RIF)、反复生化妊娠(recurrent biochemical pregnancy,RBP)及早期复发性流产(recurrent spontaneous abortion,RSA)等。其中,RIF属于着床失败的一种类型,发生于应用辅助生殖技术治疗中。RIF大多是由于胚胎与子宫内膜建立紧密联系之前的某个环节发生异常,导致胚胎不能着床;而RBP是指胚胎已经开始着床,其分泌的人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,HCG)进入母体血液并达到可检测出的水平,但没有继续妊娠至能用超声诊断出孕囊的阶段;RSA则是发生在胚胎着床以后临床妊娠的丢失。可见,RIF、RBP及RSA均属于APO的范畴,但发生在不同的生理阶段[23]。然而,也有学者提出,RSA应该包括连续发生的生化妊娠[24]。
2.1RIF 随着辅助生殖技术的应用,目前RIF已成为限制其发展的热点与难点问题。RIF通常被定义为移植4个或4个以上高质量胚胎后,仍未能实现临床妊娠,其患病率为10%~15%[25-26]。有学者提出,胚胎成功种植的免疫机制包括:①胚胎滋养细胞、胎盘膜能保护胚胎不受母体免疫细胞的攻击;②绒毛外滋养细胞中人类白细胞抗原Ⅰ类分子表达的改变,能够调节母胎界面母体成分中自然杀伤细胞、巨噬细胞和辅助T淋巴细胞的功能;③各种细胞因子(白细胞介素-10、白细胞介素-4等)和补体在母胎界面的免疫调节中发挥关键作用[27]。胚胎作为半同种异体移植物,不仅与母胎界面免疫调节密切相关,且其种植是否成功与胚胎质量、子宫内膜容受性(endometrial receptivity,ER)两方面因素均有关。ER通常是指子宫内膜在激素调控下、月经周期的第20~24天(“种植窗”)内处于允许胚胎着床的接受状态[28]。既往有关胚胎种植的研究大多以胚胎为中心,而对子宫内膜因素的研究较少。近年来,国内外学者针对ER降低进而影响RIF的研究逐渐增多,主要集中在子宫内膜厚度、形态类型及子宫动脉血流上。如土增荣等[29]研究发现,粒细胞集落刺激因子联合LMWH能明显改善薄型子宫内膜(厚度≤7 mm)RIF患者的胚胎种植率及临床妊娠率。谭小方等[28]观察并提出,LMWH能够降低RIF患者子宫动脉血流阻力指数和血流速度峰谷比,增加胚胎种植时子宫动脉的血供、提高ER,进而改善种植结局。此外,牛凯迪等[30]提出良好的ER可能减少RIF的发生,且ER与基因多态性、免疫细胞、黏附分子及非编码RNA均有内在的联系,有待进一步深入研究。然而,Siristatidis等[31]提出,LMWH与泼尼松联合应用于RIF患者并不能提高临床妊娠率。这与上述研究结果相互矛盾,但不排除样本量过小引起的临床偏倚。另外,有学者亦关注到LMWH的降脂作用与体重及RIF之间的相关性。如齐改梅等[32]提出,LMWH能提高PTS合并超重的RIF患者再次移植的妊娠成功率。因此,需进一步研究LMWH降血脂的具体作用机制,以期为改善早期APO提供新思路。
2.2RBP 生化妊娠是指发生在妊娠5周以内、血或尿中HCG阳性而超声检查宫内未见孕囊的早期流产[33]。而RBP是指连续发生≥2次的生化妊娠[13]。RBP病因复杂,有文献报道,自身免疫异常、辅助生殖、自然流产≥3次是其独立危险因素[34]。目前,许多研究集中在影响辅助生殖技术中生化妊娠发生的ER上,但临床尚无评价ER的统一指标与共识。林丹换和覃春容[35]提出,ER的超声学评估指标主要包括子宫内膜厚度、形态类型及血流动力学参数,且三者综合评价ER时效果较可靠。相关研究报道也大多集中在以上几个方面,但结果并不完全统一。如陈国庆和乔宠[36]认为,HCG注射日或黄体生成素峰日子宫内膜厚度<9 mm、子宫内膜息肉<2 cm、子宫内膜形态呈B型的患者发生生化妊娠的可能性大。楚琪等[37]则认为,薄型子宫内膜虽是影响ER的主要因素之一,但其阈值定义尚不明确,因此不能作为辅助生殖技术妊娠结局的预测指标。亦有学者提出,子宫内膜区动脉血流信号数虽对 ER有一定的预测价值,但与生化妊娠的发生可能没有必然联系[38]。可见,ER的超声学诊断指标尚不明确,仍需进一步总结规律并制订相应标准。此外,学者们亦通过在基因水平上寻找ER的标志物(同源框基因A10、血小板内皮细胞黏附分子1、黏蛋白1等)来探究LMWH提高ER的相关机制[30,39]。如牛凯迪等[39]通过米非司酮构建胚泡植入障碍模型证实,LMWH可通过Wnt通路提高ER,并推测其作用机制可能与血小板内皮细胞黏附分子1相关。另外,临床队列研究发现,生化妊娠可能会影响下次妊娠结局,因此预测生化妊娠的发生显得尤为重要[40]。Tarin等[41]进一步总结发现,在经历一系列体外受精/卵胞质内单精子注射治疗周期的女性中,生化妊娠病史与日后活产率呈负相关,并提出导致生化妊娠的最后胚胎移植周期数、女性年龄及少、弱、畸精子症3个预测因子可以很好地预测日后的活产率。以上研究结果对于临床预测具有很好的借鉴意义。
总之,ER是影响胚胎植入的一大因素,目前已知LMWH可通过Wnt通路提高ER,是否存在其他通路尚在研究中;且LMWH是否通过提高ER进而改善RBP,仍需进一步探索与验证。
2.3RSA RSA是指自然流产2次及2次以上、在妊娠28周前的胎儿丢失,其发生率为1%~5%[24,42];早期RSA则多发生于妊娠12周以内。RSA病因复杂,涉及遗传、内分泌、免疫、感染、解剖、环境及PTS等因素。其中,PTS导致RSA的证据等级为Ⅰ级;PTS主要分为遗传性和获得性两大类,前者与凝血及纤溶相关基因突变有关,后者主要包括抗磷脂综合征、获得性高半胱氨酸血症以及其他引起血液高凝状态的疾病。对于遗传与基因突变类的PTS,目前没有针对性的治疗手段;故大多数研究通过减少血栓形成及调节免疫失衡防治获得性PTS。如有学者提出,抗磷脂综合征中的抗磷脂抗体通过与内皮细胞、中性粒细胞、血小板和单核细胞相互作用促进血栓形成,此为“第一次打击”;加上制动、感染、炎症、外伤及口服避孕药等“第二次打击”因素,共同促进了母-胎界面血栓的形成[43]。另外,仍有30%~40%的流产原因不明,称为不明原因复发性流产(unexplained recurrent spontaneous abortion,URSA),可能与母-胎免疫耐受失衡有关[44]。梁昀等[45]进一步研究表明,T细胞免疫球蛋白和免疫受体酪氨酸抑制基序分子可能通过调节性T细胞发挥维持母-胎免疫耐受的作用。
此外,临床亦存在LMWH联合用药或单药使用来防治早期RSA的相关报道。如梁庆芬[46]报道,黄体酮、HCG加用LMWH治疗URSA患者可以有效促进胚胎生长发育。随后有文献进一步报道,单用LMWH同样可以提高URSA患者的妊娠成功率并减少并发症的发生[47]。一项Meta分析显示,LMWH联合阿司匹林治疗URSA患者提高活产率的机制,可能表现为保护血管内皮细胞、调节细胞增殖、降低血液黏度,最终改善子宫胎盘微循环[48]。然而,Schleussner等[49]研究表明,每日注射LMWH不会增加URSA患者的持续妊娠率或活产率,且考虑到注射的负担,不建议将其用于防治流产。Rodger等[50]的Meta分析同样显示,LMWH似乎并不能降低RSA的风险。
可见,LMWH治疗RSA时,首先需要充分评估患者,根据患者具体情况及其各项检查、化验指标,然后决定LMWH使用预防剂量还是治疗剂量,进而确定用药疗程及停药时间,同时监测相关指标,尽量避免LMWH使用不当造成的出血、过敏等不良反应的发生。
LMWH是一种呈酸性带负电荷的聚合物,具有与多种蛋白质结合的非特异性潜能。目前其所知的药理作用主要归因于与各种蛋白质的结合能力,如AT-Ⅲ、细胞黏附分子、生长因子等;但其降脂的药理作用缺乏高级别循证资料证实。此外,LMWH在防治RIF、RBP及RSA等早期APO中所发挥的作用及效果仍存在争议,亟须进行多中心、规范化的临床随机对照试验,以期阐明LMWH发挥作用的确切机制,从而提供更精准的诊治策略。另外,ER的评判标准缺乏规范,且增加ER标志物含量提高ER的研究尚处于基础实验阶段,仍需制订统一标准,并通过大量临床研究进一步验证。