105例肺癌患者外周血中miRNA-10b的表达

杨云龙，汪建中

(北华大学附属医院，吉林 吉林 132011)

肺癌是目前最常见的恶性肿瘤，其中大部分为非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)，约占肺癌患者的85%，NSCLC主要分为鳞癌、腺癌和大细胞癌3个病理类型[1].近年，随着分子生物学技术的不断发展，探寻有效的预测疗效的生物学标志是实现个性化治疗的关键，对NSCLC患者的诊断、预后具有重要的评估价值[2].MicroRNA(miRNA)是在真核生物体内发现的一类非编码性的内源性RNA，约含20～25个核苷酸，具有各种调控功能.miRNA拥有多种生物学活性，对人体的生长发育，尤其对恶性肿瘤的产生、侵袭、转移等过程有重大影响，是肺癌领域内的研究热点[3-5].本研究旨在探讨NSCLC患者外周血中miRNA-10b的表达情况与转移淋巴结、肝脑等远处转移和病理TNM分期的相关性.

1 材料和方法

1.1 材料标本

选择2015年11月—2019年11月在北华大学附属医院确诊的NSCLC患者156例，105例入实验组，51例排除.另选50例同期体检健康人员为正常对照组，所有受试者均签署临床实验告知书.采集NSCLC患者外周血清3 mL，制备用于miRNA-10b检测的RNA提取液，吸光度在1.8～2.1之间.

1.2 主要药品及设备

CFX96荧光定量PCR仪(Bio-Rad公司，美国)；BioPhotometer Plus核酸蛋白定量检测仪(Eppendorf公司，德国)；Ficoll单个核细胞分离液(天津灏洋生物制品科技有限公司)；mirVana miRNA试剂盒(Ambion公司，美国)；乙二胺四乙酸(EDTA)SYBR Premix ExTaqⅡ试剂盒(Solarbio公司，美国).

1.3 统计学分析

2 方 法

2.1 单个核细胞中RNA的提取

采集NSCLC患者外周血清3 mL，应用络合剂EDTA将外周血清抗凝，应用Ficoll液分离外周血单个核细胞，并放置在-80 ℃冰箱中保存待用；应用 miRNA试剂盒提取单个核细胞中的总RNA，进一步检测miRNA-10b浓度.

2.2 反转录PCR测定miRNA-10b

取2 μL RNA液进行反转录，再加入2 μL RT Primer+无核酸酶水，10 min 70 ℃反应后冰浴2 min.向上述混合物中依次加入RT buffer、dNTP、RNase inhibitor、RT酶、ddH2O，继续进行反转录，反应条件设定为60 min 42 ℃、10 min 70 ℃，之后维持在4 ℃左右.以反转录产物3 μL作为标准模板，应用SYBR Premix ExTaqⅡ试剂盒检测RT-qPCR，采用荧光定量PCR仪进行3次独立检验.

3 结 果

3.1 外周血单核细胞中miRNA-10b相对表达量

实验组外周血单核细胞中miRNA-10b相对表达量为1.85±0.14，而正常对照组外周血单核细胞中miRNA-10b相对表达量为1.03±0.18，实验组明显高于正常组，差异具有统计学意义(P<0.01).见图1.

图1外周血单核细胞中miRNA-10b相对表达量Fig.1Relative expression of miRNA-10b in peripheral blood mononuclear cells

3.2 外周血单核细胞中miRNA-10b表达对NSCLC的诊断价值

外周血单核细胞中miRNA-10b表达的曲线下面积(AUC)为0.870(95%CI：0.908～0.813，P<0.01)，当ROC曲线临界值(cut-off)为1.15时，诊断灵敏度(86.5%)和特异度(81.7%)最高.见图2.

图2外周血单核细胞中miRNA-10b的灵敏度和特异度 Fig.2Sensitivity and specificity of miRNA-10b in peripheral blood mononuclear cells

3.3 临床病理因素对miRNA-10b的影响

以ROC曲线临界值(cut-off)1.15为分界值，105例非小细胞肺癌患者中miRNA-10b表达≥1.15为高表达组，<1.15为低表达组，其中高表达的患者71例，低表达的患者34例.miRNA-10b表达和吸烟、病理类型、淋巴结转移情况、病理TNM分期相关(P<0.05)，吸烟史>10 a、肺腺癌、淋巴结转移患者、TNM分期较晚的Ⅱ、Ⅳ期患者高表达多，而其他临床病理因素与miRNA-10b无相关性(P>0.05).见表1.

表1 NSCLC患者临床病理因素对miRNA-10b的影响Tab.1 Effects of various factors on miRNA-10b in patients with non-small cell lung cancer

4 讨 论

目前，我国肺癌发病率和死亡率均居首位，已成为危害健康的重要疾病[6-8]，也是我国公民的首要死亡原因.由于大部分肺癌患者确诊时已处于肿瘤晚期，治疗手段有限，复发和耐药性导致其临床治愈率不高.近年来，MicroRNA(miRNA)因其可以通过调控细胞周期、介导细胞凋亡、血管生成和细胞转移来参与肿瘤的发生发展，成为目前研究的热点[9-10].

MicroRNA(miRNA)是在真核生物体内发现的一类非编码性内源性的RNA，miRNA大小约20～25个核苷酸，miRNA具有各种调控功能，它们作为基因调控因子发挥抑制靶基因表达的作用.miRNA能够阻抑蛋白翻译，通过miRNA的3’末端非翻译区调控靶基因[11-13].有研究[10]发现：非小细胞肺癌(NSCLC)患者血清中miR-146b、miR -155、miR-27a和miR-106a的表达显著降低，而miR29c的表达显著升高；肺癌患者外周血单个核细胞中的miR-155、miR-10b、miR-141的表达水平比肺良性肿瘤患者高，所以外周血单个核细胞中的 miR-10b可能作为肺癌早期诊断及治疗效果评估的分子生物学工具.

由于肺癌的恶性程度及死亡率极高，所以肺癌患者的预后评估是临床的一项重要内容，miRNA 的出现极可能为我们提供一种全新的方法.有研究[11]表明：miRNA表达水平的异常有助于判断肺癌患者预后和生存期，通过多因素分析研究也证实 miRNA-10b的高表达是一种独立因素，可预测肺癌的治疗效果.有研究[12]探讨了 miRNA-10b在肺癌细胞系PANC-1中的表达情况，并进一步探讨了miRNA-10b对肺癌细胞系 PANC-1的生物学功能的影响.结果表明：miRNA-10b的表达量在能够手术切除患者术后外周血中明显低于手术无法切除患者的表达量，同时miRNA-10b 的表达对肺癌患者生存期还具有预测作用，miRNA-10b高表达的肺恶性肿瘤患者中位生存时间为6个月，而低表达水平的患者为2 a.KHANDELWAL A等[13]在研究中发现，有46例非小细胞肺癌患者的肺癌组织及癌旁正常组织中的miRNA比正常组织中miRNA表达上升了14%，肿瘤周围正常组织中 miRNA含量与正常肺组织中含量基本接近；其中，肿瘤细胞中miRNA21含量比肺癌旁周围正常组织高2.5倍，而肺癌消失后肺组织中miRNA21含量则与正常组织接近.

本研究中，实验组患者外周血单核细胞miRNA-10b表达为1.85±0.14，而正常对照组外周血单核细胞miRNA-10b表达为1.03±0.18，实验组明显高于正常对照组，差异具有统计学意义(P<0.01).miRNA-10b表达和吸烟、病理类型、淋巴结转移情况、病理TNM分期相关(P<0.05)，吸烟史>10 a的患者高表达明显多，病理TNM分期为Ⅲ期、Ⅳ期高表达数多，而其他临床病理因素如性别与miRNA-10b无相关性(P>0.05).本研究结果显示：miRNA-10b作为一种新型肿瘤标志物，能够区别于其他肿瘤标志物，miRNA-10b外周血具有采集方便、物质稳定、阳性率高的特点，其表达高低与肺癌严重程度呈正相关，受年龄等干扰因素小，能比较客观地反映肺癌的生物学特征.

综上，miRNA为一种分子生物学标志物，可用来诊断及预测肺癌的预后，因此，深入探讨参与肿瘤发生发展的miRNA具有重要意义.