牛蛙源达卡气单胞菌的分离鉴定及毒力特性分析

潘纪汶，王昕，杨诺，韩语，郭桂英，曾纪锋，郑继平*

(1. 海南大学生命科学与药学院，海南 海口 570228；2. 海南大学理学院，海南 海口 570228；3. 海南大学动物科技学院，海南 海口 570228)

牛蛙(Ranacatesbiana)隶属于两栖纲、无尾目、蛙科。由于肉质鲜美滑嫩，营养价值丰富，其皮、油、腺体等其他组织是工业、养殖业和医药业的重要原材料[1]，目前已成为我国主要水产养殖产业之一，年产量已超15万t[2]。近年来养殖密度增加和水体环境逐渐恶化，诱发大量细菌病害例如气单胞菌菌(Aeromomas)、葡萄球菌(Staphylococcus)、爱德华菌(Edwardsiella)和链球菌(Streptococcus)等[3-5]，造成巨大的经济损失。

达卡气单胞菌(Aeromonasdhakensis)是气单胞菌属一新种。2002年，该菌首次从孟加拉达卡城的一个腹泻的儿童病例中分离获得，命名为嗜水气单胞菌达卡亚种(Aeromonashydrophilasubsp.dhakensis)[6]。2008年，该菌又从葡萄牙一个观赏鱼养殖箱水中分离得到，误认为是一个新种而命名为水族箱气单胞菌(Aeromonasaquariorum)[7]。2013年，嗜水气单胞菌达卡亚种与水族箱气单胞菌，经新的分子技术鉴定为同一分类单元，并经全基因测序分析证实达到种的水平，重新定名为达卡气单胞菌(Aeromonasdhakensis)[8]。该菌是一种人、兽和水产动物共患的机会性致病菌，对人、海豚、鳄鱼、鱼、虾等均有感染，主要表现为败血症、肺炎、胃肠炎、皮肤与软组织炎等病症[9-12]。

2019年8月，海南文昌市某牛蛙养殖场出现大量牛蛙死亡，发病牛蛙出现腹部肿胀和体表皮肤出血，剖检见大量腹水，肺充血，肝脏肿大淤血病变。本研究从发病牛蛙肝脏组织中分离获得到一株优势菌株，采用形态观察、生理生化鉴定、结合16S rRNA和gyrA基因序列系统发育分析对其进行鉴定，确认其为达卡气单胞菌；同时对该菌进行致病性试验、药敏试验、耐药基因和毒力基因检测，以期为牛蛙细菌病害防治提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 主要试验材料

病蛙来自海南省文昌市某养殖场，体重为100 ～200 g；健康牛蛙购自海口市沿江三农贸市场，体重为120 ～165 g，体表均无损伤活性较好，在25～28 ℃水温下饲养7 d； Mueller-Hinton(MH)琼脂培养基、脑心浸出液(BHI)培养基、革兰染液购自Solarbio公司；生化反应管、药敏纸片购自杭州微生物试剂有限公司；细菌基因组 DNA 提取试剂盒购自北京华越洋生物科技有限公司；2×F8 Fast Long PCR Master Mix购自北京艾德莱生物科技有限公司；DL2000 DNA Marker购自南京诺唯赞生物科技有限公司。

1.2 细菌分离纯化及形态特征观察

无菌采集患病牛蛙的心血、肺、肝、脾、肾组织样品分别划线接种于脑心浸液琼脂平板(BHI)，在28℃恒温条件下培养24 h。观察细菌的形态特征，挑取优势菌进行划线纯培养，挑取纯化后单菌落进行革兰染色，显微镜观察其形态特征。

1.3 分离菌生理生化鉴定

将分离纯化后的菌株命名为WC0803，划线于接种BHI平板中，28 ℃恒温培养12 h。将WC0803菌株接种于生化反应管，28 ℃培养24 h后观察结果，试验参照BMSAB分类方法[13]进行判定。

1.4 16S rRNA基因及gyrA基因序列测定分析

利用细菌基因组提取试剂盒提取WC0803菌株基因组DNA作为PCR扩增模板，采用16S rRNA引物(F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′/R:5′-GGTTACCTTGTTACGACTT -3′)，gyrA引物(F:5′-ATGAGCGATCTGGCCAGAGA/R：5′-CGCGCCTTGTTCACCTGATA)进行PCR扩增。16S rRNA PCR扩增程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s；55 ℃ 30 s；72 ℃ 1 min，共30个循环；72 ℃10 min；gyrAPCR扩增程序：94 ℃ 3 min；94 ℃ 10 s；55 ℃ 15 s；72 ℃ 10 min，共30个循环；72 ℃ 5 min。PCR产物纯化回收后由广州天一辉远生物科技有限公司测序，将测序结果在NCBI上进行同源性比对分析，再根据分析结果通过MEGA7.0使用Neighbor-Joining方法构建系统发育树。

1.5 抗菌药物敏感试验

采用Kirby-Bauer法[14]对WC0803菌株进行20种抗菌药物敏感性试验，使用麦氏比浊法将菌液配制为0.5 McFarland(1×108CFU/mL)浓度的菌悬液，在MH平板表面涂布均匀，28 ℃恒温培养24 h后测量抑菌圈直径，参照杭州微生物试剂有限公司抗菌药物敏感性判断标准判定结果。

1.6 耐药基因及毒力基因检测

以WC0803菌株基因组作为模板，使用耐药基因及毒力基因检测引物[15-18]进行PCR扩增，引物序列见表1。9种耐药基因分别为：β-内酰胺类耐药基因tem、ctxM；氨基糖苷类耐药基因ant3、strA；喹诺酮类耐药基因qnrA、qnrS；磺胺类耐药基因sul1；四环素类耐药基因tetA、tetC；9种毒力基因包括：气溶素(aer)、细胞兴奋性肠毒素(alt)、细胞毒性肠毒素(act)、热稳定肠毒素(ast)、磷脂酶(lip)、ADP-核糖基化毒素(aexT)、Ⅲ型分泌系统内膜组分(ascV)、弹性蛋白酶(ela)和鞭毛蛋白(fla)。

表1 引物序列信息

1.7 致病性试验

为检测WC0803菌株致病性强弱，以牛蛙为试验动物进行半数致死量(LD50)测定。采用菌落计数法将菌悬液浓度调整为2.36×109CFU/mL后，使用PBS缓冲液稀释为108～105CFU/mL共4个浓度。试验在40 cm×35 cm×37 cm的塑料桶中进行，每桶饲养健康牛蛙6只作为一组，试验组分别肌肉注射不同浓度菌悬液0.3 mL，对照组注射同等剂量无菌PBS缓冲液，连续观察7 d并记录死亡情况，解剖死亡牛蛙并采集肝、脾、肾和肠等组织进行细菌分离鉴定。

2 结果

2.1 细菌分离纯化及形态特征

从患病牛蛙心血和肝脏无菌取样的BHI琼脂上，均生长出形态单一，呈圆形，中间凸起，边缘整齐，表面光滑湿润的灰白色菌落。革兰染色镜检显示为呈单个排列的红色短杆菌，为革兰阴性杆菌。

2.2 分离菌生理生化鉴定

生化试验结果如表2所示,分离菌株WC0803生理生化特性与达卡气单胞菌参考菌株基本一致，初步判断WC0803菌株为达卡气单胞菌。

表2 分离菌株WC0803生化试验结果

2.3 16S rRNA及gyrA基因序列分析

分离菌株WC0803的16S rRNA及gyrA基因PCR扩增后，分别获得大小为1 398 bp和815 bp的片段，与预期结果一致。将测序结果在NCBI上采用BLAST进行同源性比对分析，结果显示分离菌株WC0803的16S rRNA及gyrA基因与达卡气单胞菌参考菌株同源性均为99%以上。采用MEGA7.0软件，通过Neighbor-Joining方法构建系统发育树，结果显示该菌株均与达卡气单胞菌位于同一进化分支(图1、图2)。

根据细菌形态观察、生理生化鉴定结果及16S rRNA及gyrA基因序列分析，可确定分离菌株WC0803为达卡气单胞菌。

2.4 药敏试验

采用药敏纸片法对分离菌株WC0803进行20种抗菌药物敏感性试验，结果如表3所示。该菌对头孢氨苄、头孢拉定、头孢噻吩、头孢唑林、青霉素、阿莫西林、氨苄西林、万古霉素、磺胺异恶唑和链霉素10种抗生素耐药；对卡那霉素、环丙沙星、恩诺沙星、氨曲南、四环素、头孢噻肟和庆大霉素7种抗生素敏感；对阿米卡星、复方新诺明和多西环素3种抗生素中介耐药。

•本试验分离菌珠

•本试验分离菌珠

表3 分离菌株药敏试验结果

2.5 耐药基因及毒力基因检测

耐药基因检测结果显示，在9种耐药基因中检测出5种，分别是喹诺酮类药物耐药基因(qnrA、qnrS)、氨基糖苷类药物耐药基因(ant3)和β-内酰胺类药物耐药基因(tem、ctxM)。毒力基因检测结果显示，在9种毒力基因中检测出7种，分别是ascV、aer、act、ast、lip、ela和fla，说明该菌携带多种毒力因子，表明其具有强致病性。见图3、图4。

2.6 致病性试验

采用牛蛙进行人工感染试验，结果见表4。试验组在72 h内出现死亡，死亡牛蛙体表存在大量出血点，腹腔肿大存在积液，肠道出血等症状，对照组未出现明显症状。从死亡牛蛙体内分离出菌落形态和生理生化特性与WC0803菌株一致的菌株。采用改良寇氏法计算出WC0803菌株对牛蛙的LD50为4.68×106CFU/mL，该菌致病性较强，可确认WC0803菌株为此次牛蛙死亡致病菌。

M. DL2000 DNA Maker; 1. qnA(579 bp); 2. tetA(956 bp); 3. qnrS(417 bp); 4. tetC(588 bp);5. ant3(526 bp); 6. sul1(433 bp); 7. ctxM(538 bp); 8. tem(425 bp); 9. strA(1 640 bp)

M. DL2000 DNA Maker; 1. ascV(577 bp);2. aer(430 bp); 3. act(232 bp); 4. lip(382 bp);5. aexT(226 bp); 6. ast(331 bp); 7. ela(513 bp);8. fla(608 bp); 9. alt(442 bp)

表4 分离菌株致病性试验结果

3 讨论

气单胞菌属细菌广泛存在于淡水、污水、低盐度海水及土壤等生境,近年来，本属确定了若干新种，目前至少已有36个种已被报道[19-20]，新发病原达卡气单胞菌就是一新种。达卡气单胞菌广泛分布在热带、亚热带地区，对人、海豚、鳄鱼、鱼、虾等均可感染，主要表现为败血症、肺炎、胃肠炎、皮肤与软组织炎等病症[9-11]。本研究从海南省文昌市某牛蛙养殖场发病牛蛙肝脏组织分离到一株优势菌株WC0803，经生理生化和分子鉴定确认为达卡气单胞菌，这是国内外首次报道牛蛙的达卡气单胞菌感染。

由于气单胞菌种类繁多，生理生化鉴定往往难以区分相近的种，必须结合分子鉴定来确认，但16S rRNA基因具有高度保守性，难以区分同属内亲缘关系较近物种[21]。gyrA等管家基因对气单胞菌属菌株进行系统发育分析显示了良好的分辨性和一致性，且与16S rRNA基因序列测定分析结果相符[22]。因此，本研究采用生理生化鉴定、结合16S rRNA和gyrA基因测序分析，对WC0803菌株进行鉴定，最终确定该菌为达卡气单胞菌。

抗菌药物敏感性试验结果显示，WC0803菌株对恩诺沙星、氨曲南、四环素和头孢噻肟等7种药物敏感，临床上可使用这些药物对由达卡气单胞菌引起的牛蛙疾病进行防治；对头孢氨苄、头孢拉定、头孢噻吩、头孢唑林等10种药物耐药，其耐药谱与先前报道的罗非鱼达卡气单胞菌CAIM1873不同[23]，其中β-内酰胺类药物占多数，这可能与耐药基因检测结果中含有β-内酰胺类耐药基因(tem、ctxM)相关。值得注意的是，药敏试验结果显示该菌对喹诺酮类抗生素如环丙沙星和恩诺沙星敏感，但是耐药基因检测显示携带有喹诺酮类耐药基因(qnrA、qnrS)，在其他研究中也发现此类表型与基因型存在差异的现象[15]。因此在使用抗生素时，应轮换使用敏感药物以减少耐药菌株产生。

牛蛙致病试验显示，菌株WC0803的LD50为4.68×106CFU/mL，表明该菌株具有较强致病性。由于达卡气单胞菌致病机制可能由多重毒力因子共同作用，因此检测菌株WC0803所携带毒力因子。毒力基因检测结果显示，在9种毒力因子中检测出ascV、aer、act等7种。其中，Ⅲ型分泌系统内膜组分基因ascV与病原菌毒力因子分泌相关；aer编码的气溶素具有细胞毒性和溶血活性，并且能够改变细胞通透性，是气单胞菌致病性的关键毒力因子[24]；act和ast编码的肠毒素具有溶血毒性并且裂解细胞，引起出血和败血症状。此外，鞭毛蛋白、磷脂酶和弹性蛋白酶在增强病原菌黏附及降解宿主细胞成分上发挥重要作用[25]。研究表明，气单胞菌致病性强弱与毒力基因型具有相关性，并且携带毒力基因数减少将会导致致病性减弱[26]。本研究中WC0803菌株携带多种毒力因子，可能与该菌株具有强致病性相关。

综上，本研究首次从发病牛蛙中分离到1株达卡气单胞菌WC0803，通过致病性试验及毒力基因检测，发现该菌具有强致病性，进一步的耐药基因及药敏试验检测结果为临床选用敏感药物提供参考。